Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Przykłady interpretacji wyników dla autoprzeciwciał i hormonów białkowych. Normy, standaryzacja Zbigniew Bartoszewicz Agnieszka Kondracka Oznaczanie frakcji hormonów wolnych, biodostępnych i całkowitych. Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki prof. dr hab.med. Ewa Bar-Andziak

Stan kliniczny pacjenta a wyniki laboratoryjne Diagnostyka Laboratoryjna Dostarcza informacji na temat stanu zdrowia chorego na podstawie badań materiału biologicznego Jaki materiał? Sposób pobrania? wyniki badań laborato- ryjnych stan kliniczny LEKARZ DIAGNOSTA próbka Przykład Tg: norma < 50-55 ng/ml NORMA KLINICZNA NORMA LABORATORYJNA

Materiał biologiczny pobierany: Krew (surowica, osocze) Metodami nieinwazyjnymi Metodami inwazyjnymi Cały pacjent Ślina Krew (surowica, osocze) Komórki i tkanki (biopsje, resekcje) Mocz i kał Komórki nabłonka Szpik kostny Naskórek Wewnętrzne płyny wydzielnicze Włosy Paznokcie Mózgowo-rdzeniowy Wydychane powietrze Stawowy (wysiękowy) Surowiczy Owodniowy Przewodu pokarmowego

Metody immunochemiczne (1) Wszystkie analityczne metody immunochemiczne przeznaczone są do identyfikacji antygenów i przeciwciał Ag antygen Ab przeciwciało Stężenie zdecydowanej większości hormonów jest oznaczane metodami immunochemicznymi

Metody immunochemiczne (2) Jakie substancje chemiczne możemy oznaczać? Każdą substancję, przeciwko której jesteśmy w stanie wyprodukować przeciwciało a w przypadku oznaczania przeciwciał jesteśmy w stanie wyizolować antygen Większość substancji istotnych z klinicznego punktu widzenia: - białka (w tym przeciwciała) , peptydy glikobiałka, glikopeptydy - hormony niebiałkowe (np. tarczycy FT3,FT4), hormony sterydowe (np.DEHAE-S, kortyzol) - leki i ich metabolity, witaminy - lipidy, cukry (np.glikowana hemoglobina) - materiał genetyczny (DNA, mRNA)

Metody immunochemiczne (3) W jakim materiale biologicznym oznaczamy ? Nazwa metody Materiał do analizy Testy immunodiagnostyczne (immunoassay) Surowica i osocze krwi, płyny wysiękowe (np. z jamy stawowej), płyn z opłucnej, płyn mózgowo- rdzeniowy, mocz, ślina Immunocytochemia (komórki) Komórki Immunohistochemia Tkanki, biopaty Hybrydocytochemia (technika FISH sonda znakowana fluor. DNA lub RNA preparatów mikroskopowych Bloting, bloting in situ Homogenat materiału tkankowego lub komórek, tkanki

Metody immunochemiczne (4) Zasady działania Podstawowa zasada działania wszystkich analitycznych metod immunochemicznych polega na utworzeniu kompleksu ( wiązania) przeciwciało - antygen ka Zależność od: - pH - Temp - Siły jonowej Ag + Ab Ag-Ab kd + Warunkiem koniecznym do prawidłowego oznaczenia analitu metodą immunochemiczna jest wysoka jakości użytego przeciwciała lub/i antygenu

1) Adsorpcja (opłaszczanie) na powierzchni fazy stałej Testy immunochemiczne heterogenne 1) Adsorpcja (opłaszczanie) na powierzchni fazy stałej

Metody immunochemiczne (5) Antygen Antygenem nazywamy substancję, która sama (immunogen) lub po sprzężeniu (hapten) z odpowiednim nośnikiem po wprowadzeniu do organizmu obcego jest w stanie wytworzyć przeciwciała oraz swoiście się z nimi wiązać Reakcje: lektyna – determinanta cukrowa hormon-receptor nie są reakcjami immunologicznymi Nie każdy antygen jest immunogenem Antygenem może być immunogenna substancja nierozpoznawalna przez układ immunologiczny organizmu jako własna Autoantygeny

Antygeny – immunogeny w endokrynologii „Dobre” immunogeny - duże białka Tg, TSH, NIS, rTSH, TPO „Średnie” immunogeny – małe białka, peptydy, glikopeptydy PRL, hGH, LH. FSH, insulina Hormony słabo lub nieimmunogenne -hormony sterydowe (T, cort, Prog, 17-OH prog), fT3, fT4 - polisacharydy Im większy ciężar cząsteczkowy antygenu i bardziej zróżnicowana jego struktura tym lepszym jest immunogenem

Zmienność antygenów – izoformy Różne kopie genów (splicing) Postranslacyjne modyfikacje 3. Epitopy ciagłe 3-6 aa nieciągłe (przestrzenne) 12-15 aa Glikozylacja Fosforylacja i sulfatacja Deamidacja Proteoliza Tworzenie się agregatów

Metody immunochemiczne (6) Typy odpowiedzi immunologicznej Odpowiedź komórkowa Odpowiedź humoralna

Produkcja przeciwciał (KLH) –keyhole limpet hemocyanin (BSA )– bovine serum albumin sprzęganie Antygen (hapten) + nośnik Immunogen Przeciwciała poliklonalne Przeciwciała monoklonalne Hodowla szpiczaka Immunogen + emulgator Kolejne immunizacje Przeciwciała Ig G Podstawowe cechy „dobrego” przeciwciała: selektywność (swoistość) do antygenu (ka ) brak reakcji krzyżowych ze związkami zbliżonymi strukturalnie do antygenu niskie wiązanie niespecyficzne (NSB)

Fc Fab Znacznik E1 E2 Cechy znakowania: ilość, jakość znacznika zwiększająca czułość znakowanie nie powinno zmieniać własności przeciwciał (selektywność, siła wiązania, reakcje krzyżowe) oraz antygenu (maskowanie epitopów, struktura przestrzenna) Znacznik E1 E2

Rodzaje techniki pomiarowej - znaczniki Rodzaj znacznika Nazwa metody Bez znacznika Immunoelekroforeza, immunodyfuzję radialną. neflometria, turbidymetria – bezpośredni pomiar kompleksu immunologicznego Radioizotopy: J125, Co57, H3, C14 RIA - (RadioImmunoAssay - radioimmunologiczna) IRMA (ImmunoRadioAssay - immunoradiometr.) Enzymy: fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, b-D-galaktozydaza EIA - (EnzymeImmunoAssay - immunoenzymatyczna) Fluorofory: fluresceina, kumaryna,europ Eu+3, terb Tr+3 FIA - (FluorecsenceImmunoAssay) Luminofory: estry akrydyny, pochodne izoluminolu LIA / CLIA - (ChemiLuminescenceImmunoAssay) ECL / ECLIA - (Ele ktroChemiLuminescenceImmunoAssay) Ligandy: biotyna, awidyna, digoksygenina, lektyny

Liniowość metod (zakres pomiarowy) ECL LIA FIA EIA RIA 2000 4000 6000 8000 10000

Testy do oznaczania TSH Kolejne generacje testów w zależności od czułości analitycznej Testy I generacji - < 1,0 mU/ml Testy II generacji - < 0,1 mU/ml Testy III generacji - < 0,01 mU/ml

Test bezpośredni Ag (immunohistochemia)

Test pośredni Ag (immunohistochemia) + Ag + Ab Ag-Ab + Ag-Ab + IIAb Ag-Ab-IIAb* znakowane przeciwciało anty-Ab

Test Pośredni Ab (autoprzeciwciała tarczycy) + aTPO TPO Ag + Ab Ag-Ab + aTPO TPO Ag-Ab + IIAb Ag-Ab-IIAb* znakowane przeciwciało anty-Ab Zastosowanie: Oznaczanie autoprzeciwciał

Normy dla ATPO, ATG i TBII Test i producent Wynik Negatywny Pozytywny Zakres pomiarowy ATG Diamed (ELISA) Cogent Diagnostics(ELISA) Brahms (LUMItest) Abbott/AXSYM (MEIA) Roche/ELECSYS (ECLIA) < 100 IU/ml > 190 IU/ml <225 IU/ml > 325 IU/ml < 115 U/ml < 34 IU/ml < 115 IU/ml 60 – 5000 ? 5 – 7500 2 - 1000 10 – 4000 ATPO Cogent Diagnostics (ELISA) <16 IU/ml > 24 IU/ml < 60 U/ml < 12 IU/ml < 63 IU/ml 30 – 2500 5,5 – 3000 1 1000 5-600 TBII (TRAb) Brahms (LUMItest TRAK) < 1,0 IU/l > 1,5 IU/l <1,5 >1,75 IU/l 0,1 – 40 0,3 - 40

Czynniki wpływające na wartości referencyjne (norma, wartości odcięcia, wartości graniczne, wartości decyzyjne)  Czynniki genetyczne (rasa) dh.alk. Wiek, płeć (T, PRL) Czynniki środowiskowe (ATG)  Cykl dobowy ACTH, kortyzol, PRL, GH  Otyłość zmienia dobowy rytm ACTH, kortyzol Niedożywienie oraz dieta wegetariańska Aktywność, pozycja ciała aldosteron  Stres i stany pooperacyjne podwyższają stężenie ACTH i kortyzolu w ciągu 15 min, normalizacja następuje w 8-10 godz. po ustaniu stresu.  Doustna antykoncepcja czy HTZ u kobiet zmieniają wyniki oznaczeń tyroksyny i kortyzolu  Warunki laboratoryjne (gł. metody manualne)

Czynniki wpływające na zróżnicowanie wyników antyTPO i antyTG Natura autoprzeciwciał Trudność z definiowaniem stężenia odcięcia dla wyników pozytywnych Brak międzynarodowych wzorców Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu Różnorodność analityczna w procedurach testów (np. typ płukania 1 lub 2-stopniowe wpływa na dokładność wyników) 1. Tozzoli, R. et al. (2002). Clin. Chem. Lab Med., Jun; 40(6):568-73

Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu Antygeny otrzymywane z tkanki zwierzęcej Antygeny rekombinowane Antygeny ludzkie aTPO TPO hTPO

Metody z ograniczona ilością przeciwciała (kompetycyjne) Niedomiar przeciwciała wychwytującego + + Ag Ab-Ag Ab + Ag* Ab-Ag* Zastosowanie: niskocząsteczkowe hormony sterydowe, T3, T4, PRL

Metody z nadmiarem odczynnika metody niekompetycyjne- kanapkowe (sandwich assay) Nadmiar przeciwciała wychwytującego + E1 E2 E1 Ab1 + Ag Ab1-Ag + E1 E2 E1 E2 Ab1-Ag + Ab2* Ab1-Ag-Ab2* Zastosowanie np. Intact PTH

Co chemy a co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Cel Pomiar Stężenie Hormonu A Interferencje Czy przeciwciała użyte w teście rozpoznają substancje inne niż hormon A? Czy hormon A jest homogenny?

Interferencje w metodach immunochemicznych Interferencje w diagnostyce laboratoryjnej można określić jako wpływ substancji obecnej w próbce badanej, polegający na zmianie prawidłowej wartości wyniku danego parametru wyrażonego zwykle jako stężenie lub aktywność Efekty matrycowe (im mniejsza objętość próbki w stosunku do mieszaniny reakcyjnej tym mniejsze prawdopodobieństwo interferencji Heterogenność oznaczanego analitu w próbce Reakcje krzyżowe – wiązanie się przeciwciała z substancją inną niż analit Czynniki wpływające na zmianę stężenia hormonu (np. leki, stres, infekcje, alergie, zakażenia, dieta)

Heterogenność hormonów glikozylacja, fosforylacja Izoformy o podobnym ciężarze cząsteczkowym Autoprzeciwciała, przeciwciała heterofilne białka wiążące Enzymy proteolityczne metabolity Hormon A Agregaty i prohormony Produkty degradacji W jakim stopniu heterogenny hormon A jest rozpoznawalny w teście immunochemicznym ? Wynik?

Heterogenność oznaczanego hormonu (1) (PRL) Roche Elecsys Beckman Access

Heterogenność oznaczanego hormonu (2) IZOFORMY PROLAKTYNY CIĘŻAR CZĄSTECZKOWY (kDa) AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA (liczona względem formy monomerycznej) WYSTĘPOWANIE i WŁASNOŚCI Fragmenty Proteolityczne   Monomeryczne Podstawowa „little PRL” Glikozylowana 16  22-23 25  ? 100% zwykle niższa lub niezmieniona  Wiąże się z krótką rozpuszczalną formą receptora PRL Zwykle stanowi 85%-95% całkowitej PRL w surowicy ludzi zdrowych Może być formą dominującą w trzecim trymestrze ciąży. W hiperprolaktynemii jej ilość maleje wraz z nasileniem objawów Agregaty Dimery „big PRL” (b- PRL) duża cząsteczka PRL 50-60 Niższa lub porównywalna Do 10% całości prolaktyny w surowicy, gł. dimery „big-big PRL” (b-b.PRL) bardzo duża cząsteczka PRL „ultra big PRL makroprolaktyna (kompleksy PRL z przeciwciałami IgG) > 100 150-170 lub > Mniejsza lub nawet zerowa w porównaniu z monomeryczną PRL Dominujące w ok. 25% hiperprolaktynemii idiopatycznej, 2.9% ciąży (3 trymester), obecne w prolaktinoma

Oznaczanie makroprolaktyny metodą z PEG-iem (1) Heterogenność oznaczanego hormonu (3) Oznaczanie makroprolaktyny metodą z PEG-iem (1) Podwyższony poziom prolaktyny w surowicy: - Precypitacja 1:1 surowicy z 25% PEG-6000% PEG 6000 w stos. 1+1 po 10 min. odwirować przy 2000g przez 5 min. oznaczyć w supernatancie poziom prolaktyny obliczyć % odzysku w stos. do próbki natywnej: [stęż. PRL po precyp. z PEG] x 2 % odzysku = 100 x [stęż. PRL w próbce natywnej]

Heterogenność oznaczanego hormonu (5) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Epitop 2 E2 E2 E1 E2 B A + B Enzymy proteolitycze Test kompetycyjny A C Epitop 1 A + C E1 E1 Który fragment jest bioaktywny? Który fragment ma znaczenie diagnostyczne?

Heterogenność oznaczanej substancji (6) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Epitop 2 E2 E2 E1 E2 B Epitop 2 E2 E2 Tylko A Test kanapkowy Enzymy proteolityczne A C Epitop 1 E1 E1 A + C

Degradacja cząsteczki PTH pod wpływem enzymów proteolitycznych Pre-proPTH bioaktywny N-PTH 1-34 Intact-PTH (i-PTH) 1-84 7-84 N N Brak aktywności biologicznej Mid-molecule PTH 35-64 44-68 C-PTH 35-84 C C C Nagromadza się w niewydolności nerek Nagromadza się w niewydolności nerek

Degragacja cząsteczki proopiomelanokortyny (POMC) Oddziaływania z prekursorami hormonów (pro-hormonami) Degragacja cząsteczki proopiomelanokortyny (POMC) przez konwertazy prohormonalne PC1 i PC2 1 241 N- Pro-opiomelanokortyna (POMC) ACTH -C PC1 1 150 153 241 Pro-ACTH ACTH -LPH PC1 1 78 112 150 Człowiek PC2 N-POC JP ACTH PC2 79 108 PC2 Inne ssaki 51 76 112 124 130 150 153 208 211 241 g3-MSH αMSH CLIP g-LPH β-EP

Aktywność biologiczna prekursorów i fragmentów hormonu adenokortykotropowego (ACTH) Propiomelanokortyna (POMC) 1-241 - niska aktywność biologiczna pro-ACTH 1-150 8-100% bioaktywności ACTH w zależności od metody pomiaru 1 39 100% bioaktywności N- ACTH -C 1 18 19 39 1-18 19-39 Niska bioaktywność ale ma wpływ na okres połowicznego rozpadu ACTH 100% bioaktywności 1 24 (1-24) ACTH Syntetyczny ACTH (synacthen) 100 % bioaktywności

Reakcje krzyżowe Nawet najlepsze przeciwciała nie są całkowicie selektywne i mogą dawać reakcje krzyżowe z antygenami o zbliżonej budowie Metody eliminacji reakcji krzyżowych: izolacja ligantu przed oznaczniem (ekstr. peptydów na kol. Sep-PAK) zmiana warunków reakcji (temperatury, czasu inkubacji) destrukcja substancji interferującej zmiana przeciwciał na bardziej swoiste

Hormony Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Ich prekursory (prohormony) Produkty proteolitycznego rozpadu Agregaty Hormony zmutowane Hormony homologiczne Inne anality reagujące z przeciwciałami używanymi w teście

różne wyniki poziomu prolaktyny przy prawidłowo działającym sprzęcie ? W jednym laboratorium wynik stężenia PRL pacjentki o godz 9:23 wyniósł 33,28 ng/ml W tym samym dniu o godz 10:27 w innym laboratorium wynik stężenia PRL tej samej pacjentki wyniósł 111,41 ng/ml Czy z medycznego punktu widzenia możliwe jest aby pacjentka w tym samym dniu miała dwa diametralnie różne wyniki poziomu prolaktyny przy prawidłowo działającym sprzęcie ? Czy znane były warunki pobrania krwi do oznaczeń dla obu laboratoriów? Czy ustalono producenta i rodzaj testów do oznaczeń prolaktyny zastosowanych w obu laboratoriach? Czy sprawdzono wyniki kontroli wewnętrznej oraz kalibracji prolaktyny dla tych testów, na którym wykonano oznaczenie prolaktyny pacjentki w obu laboratoriach w dniu oznaczenia?

Cechy idealnego międzynarodowego wzorca dla hormonów białkowych Powinien być czysty chemicznie i trwały (uwaga na glikobiałka) Powinien odzwierciedlać możliwą heterogenność hormonów (różny poziom pro-hormonów, podjednostki, fragmenty, kompleksy, podtypy) Powinien być łatwo i przez długi okres dostępny Stężenie powinno być wyrażone w jednostkach układu SI (mole/l) lub jednostkach międzynarodowych U/l Jednostki zajmujące się standaryzacją: - Expert Comittee on Biological Standarization (ECBS) przy WHO - Institute for Reference Materials and Measurments (IRMM) - Bureau Communautaire de Reference (BCR) - National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) - National Comittee for Clinical Laboratory Standarization (NCCLS)

Standardy i kalibratory Pierwotny materiał referencyjy materiał wykazuje własności na tyle homogenne i dobrze zdefiniowane aby mógł służyć do kalibracji aparatu, oceny pomiaru lub ustanowienia wartości. Może to być czyste białko (rekombinowane lub oczyszczone ze zlewkowej surowicy ludzkiej) według jednoznacznie opisanej procedury. Powinien mieć długą trwałość a jego ilość przygotowana jednorazowo powinna wystarczyć na minimum kilkanaście np.30 lat. Wartości tego białka określone są metodami definitywnymi ( metody najbardziej precyzyjne zgodne z aktualnym stanem wiedzy nadające się dla wszystkich wzorców Drugorzędowy materiał referencyjny jego wartości odpowiadają standardowi pierwotnemu ale są określone przy zastosowaniu metod referencyjnych (np. metoda rozcieńczeń izotopowych połączonej z GC i MS (ID-GCMS). Pożądane własności : akceptowalny (certyfikowany) na forum międzynarodowym ( np. hormony: LH, FSH, PRL, TSH); szeroko dostępny, stabilny i dobrze sprecyzowany możliwie oparty na surowicy ludzkiej o własnościach zbliżonych do substancji natywnych w surowicy o podobnych własnościach dla różnych metod; otrzymywany w precyzyjnie ustalonych protokołach produkcji Materiały kontrolne (kalibratory, standardy firmowe) np. dla T, Prog., Estriolu, FT3, FT4). Służą do rutynowej wewnętrznej kontroli jakości: krótszy okres trwa- łości (kilka miesiecy) gorzej sprecyzowane i akceptowalne na zewnątrz laboratorium

Przeciwciała stymulujące w chorobie G-B M. Jakóbisiak 1998 R. Di Lauro, M. De Felice 2001

Thyrotropin receptor autoantibodies (TRAbs) Autoantibody Mechanism of action Clinical effect Stimulating the thyroid TSI (thyroid stimulating immunoglobulins) TSAb (thyroid stimulating antibodies) Stimulating TSH-R in substitution of TSH or incrasing the TSH effectiveness, increasing the receptor half-life Hyperthyroidism in G-B Hyperthyroidism of infants Blocking the thyroid stimulation TBAb (thyroid blocking antibodies) TSBAb (thyroid stimulating-blocking antibodies Blocking the TSH-R activation by TSH and stimulatory antibodies. Blocking the binding the TSH and antibodies to TSH-R Present in different autoimmune thyroid inflamation, in majority of patients with G-B, May produce hypothyroidism Blocking the binding of TSH to TSH-R TBII (TSH binding inhibitory immunoglobulins) TBIAb (TSH binding inhibitory antibodies) Blocking the binding of TSH to its receptor. Can stimulate or inhibit the receptor activity by ligands Present in G-B, autoimmune thyroid diseases Stimulation the thyroid growth TGI (thyroid growth immunoglobulins, thyroid growth stimulating immunoglobulins) Questionable. There is no evidence that TSH-R is the only antigen, cAMP is not a messenger. Present in G-B Inhibit the thyroid growth TGI-block (thyroid growth immunoglobulin blocking There is no evidence that the TSH-R is an antigen Present in hypothyroidism Neutral Binds TSH-R but doesn’t influence its function Present in G-B, lack in healthy individuals Multifunctional Binds TSH-R Not known

Pomiar stężenia przeciwciał TBII (kompetycyjne) TBII – przeciwciała blokujące miejsce wiązania TSH do jego receptora Niedomiar związanego przez MAb natywnego TSH-R TSH nTSH-R TSH MAb + + TSH nTSH-R + MAb + TSH nTSH-R TSH MAb nTSH-R MAb

TPO i TG są głównymi autoantygenami AITD Peroksydaza Tarczycowa Enzym konieczny do syntezy T3 i T4 TPO Tyreoglobulina Białko na którym T3/T4 są syntetyzowane Tg Przeciwciała generowane w chorobach tarczycy: Choroba Hashimoto Choroba Graves’a Nohr S.B. et al. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:3191-8.

Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (1) Wszystkie immunochemiczne metody kompetycyjne opierają się na pomiarze niezajętych przez analit miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego Znakowany antygen Analog antygenu Przeciwciało blokujące

Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (2) Wszystkie immunochemiczne metody niekompetycyjne opierają się na pomiarze zajętych przez analit miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego