Podstawy terapii genowej Wprowadzenie do zagadnień terapii genowej

Podstawy terapii genowej STRATEGIE TERAPII GENOWEJ: I Komplementacja defektu genetycznego polega na łagodzeniu skutków biologicznych defektu genetycznego przez wprowadzenie prawidłowego genu (nie usuwa defektu) Przykład: mutacja punktowa w ORF genu β-globiny prowadzi do anemi sierpowatej (zamiana 1 aminokwasu – tetramery α i β-globiny tworzą strąty); wprowadzenie prawidłowego genu β-globiny do komórek macierzystych erytrocytów → wytwarzanie normalnych erytrocytów

Podstawy terapii genowej Wprowadzanie genów do komórek docelowych: A. in vivo – wprost do organizmu (domięśniowo, doguzowo, systemowo – tj. do krwi) celowane wprowadzanie jest możliwe przez zastosowanie: wektorów wirusowych o określonym tropizmie, nośników (np. liposomy) zawierających odpowiednie ligandy B. ex vivo – poza organizmem; polega na pobraniu komórek (szpik, limfocyty, mioblasty), ich hodowli oraz modyfikacji genetycznej i wprowadzeniu do organizmu

Podstawy terapii genowej Powodzenie komplementacji zależy od wielu czynników: dostarczenie genu do określonych komórek np. w leczeniu mukowiscydozy – do komórek nabłonka oddechowego, w nowotworach – do guza ale też do węzłów chłonnych, limfocytów, komórek dendrytycznych gdy suplementacji ulega białko surowicy – dowolna komórka (np. mięśniowa, skóry) może produkować aktywne białko wydzielane do krwiobiegu, np. czynniki krzepnięcia w leczeniu hemofilii 2. przygotowanie konstruktu genowego o dużej i trwałej aktywności (dobór odpowiedniego promotora) 3. wybór komórek o długim czasie życia

Podstawy terapii genowej Ograniczenia metody komplementacji: wielkość genu wydajność transferu konstruktu genowego do komórek docelowych wprowadzenie transgenu, który integruje do genomu gospodarza: wyciszenie transgenu lub/i insercyjna inaktywacja genu gospodarza okres utrzymywania się efektu bezpieczeństwo (reakcje immunologiczne) choroby związane z mutacjami dominującymi-negatywnymi

Podstawy terapii genowej II Hamowanie ekspresji genu Specyficzne hamowanie ekspresji zmutowanego lub nadmiernie aktywnego genu (wyciszanie na poziomie DNA lub mRNA) protonkogeny – normalne geny odpowiedzialne za regulację podziałów komórkowych, różnicowanie i wzrost (myc, ras, abl) onkogen – powstaje na skutek aktywacji protoonkogenu; bierze udział w promocji nowotworów aktywacja protoonkogenu zachodzi na skutek: transdukcji, mutacji, translokacji, amplifikacji

Podstawy terapii genowej Hamowanie ekspresji genu przez: 1. oligonukleotydy antysensowne (ASO) – oligonukleotydy liczące około 20 nukleotydów, których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub DNA wyciszanego genu; wyciszanie przez: degradację mRNA (aktywacja RNAzyH) steryczną przeszkodę dla aparatu translacyjnego mechanizm epigenetyczny 2. rybozymy – krótkie cząsteczki RNA o właściwościach nukleolitycznych, które wiążą się do określonego fragmentu mRNA i przecinają wiązanie fosfodwuestrowe w specyficzych miejscach

Podstawy terapii genowej Rybozym o strukturze młotka (hammerhead rybozyme)

Podstawy terapii genowej 3. interferujący RNA (siRNA, small interfering RNA) – małe cząsteczki dwuniciowego RNA (20-25 nt), które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji (interferencja RNA, RNAi – RNA interference). Działanie przez: indukcję degradacji mRNA blokowanie translacji

Podstawy terapii genowej III Korekta wadliwego genu Naprawa mutacji o charakterze trwałym Wykorzystuje: enzymy naprawiające błędne sparowania (mismatch repair) enzymy wycinające nukleotydy (excision repair) enzymy biorące udział w rekombinacji homologicznej Przykład: fragmenty DNA (400-800 pz) zawierające sekwencję homologiczną do naprawianego genu oraz prawidłową sekwencję do podstawienia (homologiczne podstawianie małych fragmentów, small fragment homologous replacement - SFHR); wydajność do 10% [Oligonucleotides. 2006 Sep;16(3):213-24 metoda SFHR w konwersji β-globiny sierpowatej do prawidłowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych]

Podstawy terapii genowej IV Celowana eliminacja komórek Precyzyjne zabijanie komórek zainfekowanych wirusem lub komórek nowotworowych Dla nowotworów: eliminacja bezpośrednia a. wprowadzenie do komórek genu kodującego toksyczne białko (pod kontrolą promotora specyficznego dla nowotworów) b. stosowanie genów samobójczych – przekształcających podawany systemowo prolek do toksycznego leku (np. deaminaza cytozynowa z E. coli przekształca 5-fluorocytozynę do 5-fluorouracylu; kinaza tymidynowa HSV – fosforyluje gancyklowir c. radiouczulanie - deaminaza cytozynowa d. geny proapoptotyczne – indukujące apoptozę (kaspazy, Bax) 2. eliminacja pośrednia a. przez aktywację odpowiedzi immunologicznej b. hamowanie angiogenezy

Podstawy terapii genowej V Wprowadzenie dodatkowych genów Nadanie komórkom nowej cechy fizjologicznej lub wzmocnienie już cechy posiadanej Przykłady: geny immunomodulacyjne – głównie cytokiny (IL-2, GM-CSF tj. czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) → nowotwory geny o funkcji ochronnej – podawanie genów oporności wielolekowej (MDR) do szpiku kostnego przed chemoterapią → nowotwory geny antyangiogenne – angiostatyna, endostatyna, tkankowe inhibitory metaloproteaz (TIMP) → nowotwory geny proangiogenne – indukowanie terapeutycznej angiogenezy (naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu - VEGF) → miażdżyca, choroba niedokrwienna serca

Modyfikacje genetyczne Ogólna zasada postępowania przy modyfikacjach genetycznych (wprowadzanie dodatkowych genów, hamowanie aktywności genów)

Modyfikacje genetyczne Systemy ekspresyjne stosowane do otrzymywania związków rekombinowanych: Układy prokariotyczne: Escherichia coli – nie zawsze obróbka potranslacyjna jest efektywna → powstają nieaktywne białka Układy eukariotyczne: Saccharomyces cerevisiae Ustalone linie komórkowe zwierzęce i ludzkie (np. CHO – chinese hamster ovary, COS – african green monkey kidney)

Metody wprowadzania DNA do komórek Modyfikacje genetyczne Metody wprowadzania DNA do komórek Komórki prokariotyczne (E. coli), drożdże: Elektroporacja Generowanie komórek kompetentnych Transformacja protoplastów Komórki eukariotyczne (ustalone linie komórkowe): metody niewirusowe fizyczne chemiczne metody wirusowe Wprowadzony do komórki gospodarza obcy gen (transgen) może ulec integracji z genomem gospodarza lub pozostać na terenie cytoplazmy jako forma autonomiczna tzw. episom.

Modyfikacje genetyczne Metody fizyczne Elektroporacja mikroiniekcja Transfekcja przy użyciu ultradźwięków Immunoporacja „Gene gun” (transfekcja balistyczna)

Modyfikacje genetyczne mikroiniekcja – roztwór DNA wstrzykiwany do pojedynczych komórek pod kontrolą mikroskopu (tworzenie organizmów na poziomie przedzarodkowym)

Modyfikacje genetyczne elektroporacja – czyste DNA wprowadzane do zawiesiny komórek (komórki krwiotwórcze lub macierzyste) lub in vivo (mięśnie, wątroba, naczynia) – krótki impuls elektryczny wywołuje chwilowe przerwanie ciągłości błony komórkowej

Modyfikacje genetyczne balistyczne – drobinki złota lub wolframu pokryte DNA wstrzeliwane do mięśni lub skóry (fala uderzeniowa generowana rozprężającym się gazem lub prochem), stosowane też w hodowlach komórek

Modyfikacje genetyczne Metody chemiczne Lipofekcja (liposomy) Precypitacja (fosforan wapnia) DEAE – Dekstran (diethylaminoethyl-dekstran) PEI (polietylenoimina) Kompleksy liposomowo-polimerowe (z polilizyną, PEG)

Modyfikacje genetyczne Kompleksy liposomowo-polimerowe dzięki ładunkowi (+) kondensują DNA (-) i wiążą się z zewn. powierzchnią błony komórkowej (-). Wnikają do komórki na zasadzie endocytozy i fuzji błon

Modyfikacje genetyczne Wektory wirusowe Wektory wirusowe to replikacyjnie defektywne wirusy, których wirusowa sekwencja kodująca została całkowicie lub częściowo usunięta na rzecz wprowadzonego transgenu. Wirusy takie mogą transdukować komórki ale nie ulegają w nich namnażaniu i nie powodują lizy komórek. Synteza cząstek wirusa zachodzi tylko w specjalnych liniach komórek eukariotycznych – tzw. liniach pakujących Najczęściej stosowane wirusy: Retrowirusy Adenowirusy AAV (adeno-associated virus) – wirusy tow. adenowirusom