Technologie rekombinacji DNA Organizmy transgeniczne

DNA – nośnik informacji genetycznej Model dwuniciowej helisy DNA Schemat genomu bakterii Haemofilus influenzae. Genom koduje ponad 1700 białek i 70 cząsteczek RNA

Replikacja DNA Struktura polimerazy DNA Działanie polimerazy DNA Schemat semikonserwatywnej replikacji DNA Podjednostka 2 polimerazy DNA

Transkrypcja Muchomor sromotnikowy wytwarza -amanityne, silny inhibitor polimerazy RNA Struktura bakteryjnej polimerazy RNA Synteza RNA przez polimerazę RNA

Biosynteza białka - translacja Białka są syntezowane w rybosomach z aminokwasów dostarczanych przez cząsteczki tRNA. Kolejność aminokwasów włączanych do rosnącego łańcucha jest określona przez sekwencję nukleotydową matrycowego mRNA, zgodnie z kodem genetycznym. Kod genetyczny Zasada: dwadzieścia aminokwasów białkowych jest kodowanych przez 61 kodonów – trypletów nukleotydowych. Ponadto trzy kodony STOP Cząsteczka tRNA Mechanizm biosyntezy białka

Podstawowe techniki inżynierii genetycznej Analiza restrykcyjna Precyzyjne, selektywne cięcie DNA przy użyciu enzymów rozpoznających specyficzne sekwencje nukleotydowe Techniki hybrydyzacyjne Techniki Southern i Northern blotting umożliwiają separację i identyfikację fragmentów DNA i RNA Sekwencjonowanie DNA Techniki umożliwiające poznanie struktury genów, czyli sekwencji nukleotydowej w cząsteczce DNA Chemiczna synteza kwasów nukleinowych na podłożu stałym Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (PCR) Umożliwia powielenie fragmentu DNA w miliardach kopii.

Analiza restrykcyjna Obraz elektroforezy żelowej po trawieniu restrykcyjnym Specyficzne sekwencje rozpoznawane przez niektóre enzymy restrykcyjne

Hybrydyzacja metodą Southerna

Klonowanie genów Powielanie bez klonowania Technologia PCR Pierwszy cykl reakcji PCR

Klon; klonowanie ? Klonowanie – w potocznym rozumieniu proces tworzenia idealnej kopii z oryginału W biologii mianem klonu określa się organizmy mające identyczny lub prawie identyczny materiał genetyczny. Klonami są więc organizmy powstałe w procesie rozmnażania wegetatywnego, takie jak kolonie jednokomórkowców, odrośla i rozmnóżki roślin, etc. Termin clone pochodzący od greckiego κλωνος (gałązka, odrośl), oznaczający roślinę wyhodowaną z ukorzenionej gałązki, wprowadzono w XIX w. w Anglii.

Klonowanie organizmów oznacza procedurę otrzymywania organizmów o takiej samej informacji genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej uprzednio jądra. Klonowanie genów - w genetyce i biologii molekularnej proces tzw. wyosobniania genu. Polega na łączeniu fragmentów materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich namnażaniu w innym organizmie. Otrzymuje się w ten sposób wiele kopii tego samego genu.Termin klonowanie genów odnosi się też do identyfikacji genów poprzez wykorzystanie procedury klonowania genów.

Klonowanie zwierząt W przypadku zwierząt zazwyczaj stosuje się technikę polegającą na przeniesieniu jądra komórki somatycznej pobranej z klonowanego osobnika, do komórki jajowej pozbawionej jądra. Proces ten tworzy funkcjonalną zygotę. Zygota ta może, jeśli się jej na to pozwoli, rozwinąć się w żywego osobnika. Dawca komórki jajowej z reguły pochodzi z tego samego gatunku. Transfer jądra do komórki jajowej innego gatunku rzadko jest skuteczny. Klony otrzymane w procesie transferu jądrowego nie są w 100% genetycznie identyczne z dawcami. W trakcie tego procesu wymienia się bowiem tylko materiał genetyczny zawarty w jądrze komórkowym, pozostawiając DNA mitochondrialny biorcy. Mitochondrialny DNA ma jednak minimalny wkład w dziedziczenie cech genetycznych.

Klonowanie zwierząt żaba Xenopus laevis (1958, 1962) karp: (1963) ? owca: (1996) pierwszy sklonowany ssak: owca Dolly małpa (rezus): (samica, styczeń 2000) świnia: (5 prosiaków z jednej świni, Szkocja - 2000) bawół: (samiec, styczeń 2001) krowa: Alpha and Beta (samica, 2001) kot: CopyCat "CC" (samica, jesień 2001) mysz: (1998) królik: (marzec-kwiecień, 2003) we Francji i Korei Południowej. muł: Idaho Gem (samiec, maj 2003) i Utah Pioneer (samiec, lipiec 2003) jeleń: Dewey (2003) koń: Prometea (samica, 2003) szczur: Ralph (samiec, 2003) muszki owocowe (2004) pies: Snuppy (kwiecień 2005)

Organizmy Modyfikowane Genetycznie Organizmy Transgeniczne GMO (z ang. Genetically Modified Organisms) Organizmy które zawierają w swoim genomie obce geny, pochodzące z innego organizmu lub zmodyfikowane geny własne

Transgeniczne myszy Gigantyczne myszy otrzymano w wyniku wprowadzenia do zapłodnionej komórki jajowej szczurzego genu hormonu wzrostu, tzw. somatotropiny. Gen, umieszczony w plazmidzie pod kontrolą Promotora genu mysiej metalotioneiny, wprowadzono techniką mikroiniekcji. Ekspresję genu indukowano podając rosnącym transgenicznym myszom wodę zawierającą kadm Transgeniczne myszy

Zwierzęta transgeniczne 1. Modyfikacje mające na celu wytwarzanie w organizmie zwierząt białek terapeutycznych. Zwierzęta jako bioreaktory Modyfikowane w tym celu są głównie krowy, kozy, owce, gdyż pożądane białka wytwarzane są w gruczołach mlecznych i wydzielane z mlekiem. Produkowana jest antytrombina - ludzki enzym - czynnik krzepliwości krwi, pozwala na kontrolę powstawania zakrzepów, produkcja antytrypsyny - stosowanej w leczeniu rozedmy płuc, erytropoetyny - leczenie anemii. Inne podejście – modyfikowane genetycznie kury: pożądane produkty są akumulowane w jajach. 2. Uzyskanie szybszego wzrostu zwierząt hodowlanych. Modyfikacje polegające na wprowadzeniu genów kodujących hormon wzrostu. W ten sposób modyfikowane były głównie ryby: karpie, łososie, ale także na zwierzętach gospodarskich, świniach, królikach, owcach. 3. Krowy dające więcej mleka, oraz mleko specjalnie przystosowane do produkcji serów. Zwiększenie laktacji – zastosowanie rekombinowanej somatotropiny bydlęcej (BST) Krowom wprowadzono dodatkowe kopie genów kodujących proteiny: beta- i kappa- kazeinę. Kazeina jest składnikiem twarogów i białych serów. Modyfikacje powoduje to, iż z mleka łatwiej jest uzyskać ser - można go uzyskać więcej z tej samej objętości mleka oraz szybciej. 4. Odporność na choroby. 5. Modyfikowane świnie jako dawcy narządów.

Mikroinjekcja DNA do zapłodnionego jaja myszy

Wprowadzanie DNA do komórek Zasada działania strzelby biolistycznej

Drobnoustroje wykorzystywane w biotechnologii Wirusy

Inne metody wprowadzania obcych genów do komórek Wprowadzanie DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich Wirusy zwierzęce i ludzkie jako wektory retrowirusy adenowirusy wirus krowianki wirus Maloneya białaczki myszy bakulowirusy (do komórek owadów) Zasad metody: wirusy namnaża się, izoluje i usuwa z nich własny materiał genetyczny, wprowadzając na to miejsce obce geny. tak skonstruowane wektory służą do wprowadzenia DNA do komórek. Niebezpieczeństwa: możliwość infekcji wirusowej, możliwość aktywacji onkogenów, możliwość rozbicia genów. Elektroporacja

Wirusowe nośniki genów Zasada ogólna: plazmidowe DNA wprowadzone do wirusów pozbawionych własnego materiału genetycznego Retrowirusy (+) Wysoka wydajność transfekcji; integracja chromosomalna (-) wielkość DNA do 10 000 pz; transfekcja tylko do komórek ulegających podziałowi; niebezpieczeństwo aktywacji onkogenów i insercyjnej mutagenezy; w zasadzie wyłącznie ex vivo. Adenowirusy Materiał genetyczny w postaci dwuniciowego DNA; nie następuje integracja chromosomalna; można transfekować komórki nieproliferujące, także in vivo. Adenowirusy II generacji (np. parwowirusy AAV) Materiał genetyczny w postaci jednoniciowego DNA; wymagają obecności wirusów pomocniczych; integracja chromosomalna w chromosomie 19 Problemy generalne: immunogenność; niebezpieczeństwo zanieczyszczenia preparatu wirusami zjadliwymi

Inne metody wprowadzania obcych genów do komórek Wprowadzanie DNA do komórek roślinnych Bakterie glebowe Agrobacterium tumefaciens zakażają rośliny wprowadzając do nich plazmid Ti, zawierający geny powodujące tworzenie guzowatych narośli Narośl powstająca w wyniku zainfekowania rośliny przez Agrobacterium tumefaciens Uproszczony schemat mapy plazmidu Ti A. tumefaciens Wektor skonstruowany na bazie Ti nie zawiera sekwencji zaznaczonych na czarno – w ich miejsce wstawiane są geny obce

Strategia antysensowa

Terapia genowa Substytucja – wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym Addycja – wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym