Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary 8.10.2013 „Obecność endofitów w tkankach roślin a odporność na patogeny korzeniowe” dr Katarzyna Kubiak, mgr inż. Miłosz Tkaczyk, dr hab. Tomasz Oszako, Marta Siebyła Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary 8.10.2013

Plants are full of microbes!!!!!!! Rośliny pozbawione mikroorganizmów stanowią wyjątki – (doświadczalne), rośliny zawierające mikroorganizmy są regułą w naturze. Fenotyp rośliny w naturze jest produktem ewolucyjnie wykształconej regulacji ekspresji genów roślinnych i bakteryjnych, dlatego większość roślin reprezentuje tzw. „ rozszerzony fenotyp” (“extended phenotype” według Dawkins (1999)). Mikroorganizmy które kształtują „rozszerzony fenotyp” roślin to mikroorganizmy: Patogeny Symbionty (mutualizm ++, komensalizm +0) Epifity Endofity (kolonizacja roślin wewnątrz komórek lub w przestworach międzykomórkowych nie powodując szkód w organizmie roślin)

Endofit oznacza = “endo” (wewnątrz) + “phyte” (roślina) Po raz pierwszy endofity zostały zdefiniowane jako mikroorganizmy (grzyby=Fungi)żyjące wewnątrz organizmu rośliny (Wilson, 1995). Grzyby i bakterie są najpowszechniejszymi endofitami roślin. Roots of Rare Wild Rice (Oryza granulate) from a Nature Reserve in Yunnan, China Neotyphodium spp. są często związane z kostrzewą trzcinową w tkankach liści. Grzyb ten produkuje metabolity wtórne toksyczne dla zwierząt roślinożernych. http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/ http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full

Endofity zasiedlają całą roślinę - ZDROWĄ !!!! http://www.frontiersin.org/plant-microbe_interaction/10.3389/fpls.2011.00100/full Endofity roślinne - Normalny Fenotyp rośliny- rośliny zdrowe (lewa rycina) Endofity grzybowe liści (A), Endofity bakteryjne liści (B), Rhizobia (C), Grzyby mikoryzowe (mikoryza arbuskularna) (D). Endofity silnie wpływają na witalność rośliny, rośliny pozbawione endofitów (prawa rycina) chorują (chlorozy, niska efektywność fotosyntezy, niska odporność na stresy i szkodniki) i często w naturze nie są w stanie przeżyć.

Pierwotnie, Endofity zostały zdefiniowane przez Wilson (1995) jako “fungi that are present in host plant tissues, during at least part of their life cycle, without causing visible symptoms.” Badania na temat endofitów powstałe w ostatniej dekadzie wskazują że definicja ta posiada wady: Mikroorganizmy rezydujące w roślinie niepowodujące szkód to nie tylko grzyby mikroskopowe ale także bakterie oraz „wirusy” Efekt „infekcji” mikroorganizmów w roślinie gospodarza jest warunkowy i może przechodzić od mutualizmu do antagonizmu (każdego rodzaju interakcji pomiędzy mikroorganizmami a roślinami), Klasyczne endofity wprawdzie nie powoduje widocznych objawów chorobowych, to mają wpływ na fenotyp rośliny: rośliny wolne od endofitów wyglądają i funkcjonują inaczej od tego samego gatunku rośliny z endofitami.

Endofity bakteryjne "bakterie endofityczne" jest to termin odnoszący się do bakterii, które kolonizują wnętrze części roślin: wnętrze korzeni, łodygi, liści lub nasion, nie powodując żadnego szkodliwego wpływu na roślinę-gospodarza (Hallmann et al., 1997). http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte http://aobblog.com/2013/05/what-bacteria-are-in-your-banana/ Endofityczne bakterie w roslinie - Medicago sativa, lucerne. ‎ Endofityczne bakterie w roślinie Musa sp, banan. .

Pochodzenie i rola endofitów w roślinie Większość endofitów pochodzi z ryzosfery lub fylosfery, jednak niektóre z nich mogą być przekazywane za pośrednictwem nasion (Ryan i in., 2007). Fylosfera = nadziemne części roślin będąca miejscem bytowania mikroorganizmów. Ryzosfera = strefa korzeniowa będąca miejscem bytowania mikroorganizmów. Bakterie te mogą promować kiełkowanie i wzrost roślin, przyrost biomasy, powierzchni liści (przem. spożywczy, energetyczny) Bakterie mogą indukować ogólnoustrojową tolerancję roślin w odpowiedzi na biotyczne lub abiotyczne stresy roślin (fitoremediacja), Bakterie mogą indukować odporności przeciwko patogenom (BIOKONTROLA).

Interakcja bakteria – gospodarz „host” Endofityczne bakterie żyjące w tkankach roślin mogą być obligatoryjnymi lub fakultatywnymi m-org. Niektóre bakterie endofityczne mogą kolonizować tysiące gatunków roślin, podczas gdy niektóre są dedykowane do określonych rodzin roślinnych (Endofity są organizmami niszowymi). Każdy gatunek rośliny jest gospodarzem jednego lub więcej endofitów (Ryan i in. 2007), zazwyczaj jeden lub dwa gatunki endofitów dominują w określonym „hoście”, (Bernardi-Wenzel i in., 2010).

Endofity – ochrona rośliny przed infekcjami patogenów korzeni Ochrona pośrednia – przez stymulacje wzrostu: Wiązanie N – produkcja białek (np. chlorofil) Produkcja fitohormonów (auksyny, cytokininy, gibereliny) Hamowanie biosyntezy etylenu (h. starzenia), Stymulacja rozwoju bakterii wiążących azot (koinokulacji soi Bradyrhizobium japonicum i Pseudomonas fluorescens) Stymulacja ” infekcji” grzybami mikoryzowymi ( pobierania wody z solami,  akumulacji cukrów, lipidów (inokulacja Azotobacter diazotrophicus – ziemniaki –  grzyb Glomus clarum) Wytwarzanie specyficznych związków - sideroforów

Ochrona bezpośrednia – przez działania antagonistyczne: Wytwarzanie specyficznych związków np. sideroforów ( powinowactwo do Fe niż patogeny, przez co hamują ich rozwój); kwasu cyjanowodorowego w zasiedlonej tkance korzeniowej roślin, ograniczającego rozwój patogenicznych grzybów; ochronne biopolimery lub glikoproteiny ( bariery ochronnej przed patogenami - lignifikacja ścian komórkowych np. jako mechanizm oporności na np. Colletotrichum - ściany komórkowe tkanki ogórka); Podnoszenie w środowisku stężenia Fe – stężenie toksyczne dla patogenów - fluoryzujący Pseudomonas hamuje rozwój patogenów Fusarium oxysporum (korzen) i Erwinia carotovora (korzeń, liść); Endofity silnie namnażają się w miejscu zaatakowanym przez patogeny –konkurują z patogenem o wodę i skł. pokarmowe (Bacillus macerans – patogeny Botrytis cinerea i Botrytis fabae) Produkcja antybiotyków (Pseudomonas putida - fenazynę - chroniącą ziemniaki przed miękką zgnilizną korzenia, wywołaną przez Erwinia carotovora) Produkcja enzymów litycznych (Serratia marcescens i Paenibacillus sp. wydzielają chitynazę wykazującą wywierać aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko Fusarium oxysporum; Bacillus cepacia poprzez produkcję β -1 3-glukanazy niszczy Rhizoctonia solani, Rhizobium. rolfsii i przez Pythium ultimum)

Endofity korzeniowe wiążące azot atmosferyczny Rola ekologiczna i ekonomiczna endofitycznych bakterii wiążących azot (bakterie brodawkowe) w komórkach korzeni roślin motylkowych (bobowatych-Fabaceae), jest dobrze poznana. Gorczyca Sinapis alba –poplon, międzyplon Pisum sativum groch – r straczkowa Każda roślina może współżyć tylko z określonym gatunkiem bakterii brodawkowych, np.: łubin współżyje z Bradyrhizobium. sp., soja – Bradyrhizobium japonicum, groch, bób i soczewica – Rhizobium. leguminosarum bv. viceae, fasola – R. leguminosarum bv. phaseoli, koniczyna – R. leguminosarum bv. trifolii. Peluszka Pisum arvens-r.pastewna, miedzyplon Kwiatostan Trifolium hybridum – r. pastewna

U roślin motylkowych bakterie z rodzaju Rhizobium i Bradyrhizobium stymulują komórki korzenia do wytwarzania brodawek korzeniowych-NODULACJA. Do brodawek bakterie przedostają się z gleby, tam się aklimatyzują, tworzą odpowiednie enzymy i warunki dla tych enzymów w komórkach roślinnych aby efektywnie wiązać azot N2 do N – amonowego i eksportowany do organów nadziemnych . Nodulacja Rhizobium w glebie, G- Brodawka korzeniowa Rhizobium - bakteroid

Rola ekonomiczna- Endofity wspomagają rozwój roślin o znaczeniu spożywczym oraz energetycznym W innych roślinach (niż motylkowe) wykryto obecność endofitów korzeniowych wiążących azot atmosferyczny np. trzcina cukrowa (przemysł spożywczy). Rośliny motylkowe : do 550 kg N/ha/rok) (Gabryś, 2002) Trzcina cukrowa: do 150 kg N/ha/rok (Baldani, 2000). Wiązanie azotu za pomocą endofitów ma miejsce także w korzeniach ryżu, kukurydzy (przem. spożywczy) ale także uprawa roślin - biopaliw – np. Miscanthus i inne trawy (przemysł energentyczny) Saccharum officinarum trzcina cukrowa Miscanthus giganteus

Metodyka Sterylizacja: alkohol 70% - 3 min.; podchloryn sodu 2,5% - 5 min.; alkohol 70%- 30 sek. i 5x woda sterylna Fragmentacja 5x5 mm; wyłożenie na podłoża stałe – Obliczenie CR Reizolowanie kultur bakteryjnych Wybór prób Identyfikacja gatunkowa bakterii wykazujących antagonizm w stosunku do patogenów korzeniowych (analiza DNA i sekwencjonowanie) Uzyskanie czystych kultur – posiew redukcyjny Testy antagonizmu: F .solani i B. amyloliquefaciens (etap kolejny)

Wyniki :Testy antagonizmu: endofit-patogen korzeniowy Analiza filogenetyczna – ML (program CLC) (dane z BLAST NCBI stopień homologii w %)

Wyniki Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn, Piaski, Karczma Borowa z powierzchni kontrolnych i testowych Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il. fragm. „kiełkujących”/ogólna il. fragm. Analiza wpływu Nadl.*wariant (ANOVA, 2 –czynnikowa; Statistica 8.0)

Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl Analizowano liście/korzenie pobrane z Nadl. Krotoszyn, Piaski z powierzchni kontrolnych i testowych Obliczono współczynnik CR (zasiedlenia endofitami) = il. fragm. „kiełkujacych”/ogólna il. fragm. Analiza korelacji CR a defoliacja, witalność, syntetyczny wskaźnik uszkodzeń drzewostanów (SYN) Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity) Wielokr. - R Wielokr. - R2 Skorygow - R2 SS - Model df - Model MS - Model SS - Reszta df - Reszta MS - Reszta F p Defoliacja [%] 0,584539 0,341686 0,302962 4395,848 1 8469,309 17 498,1947 8,823556 0,008578 Test SS dla pełnego modelu względem SS dla reszt (korelacja endofity) Wielokr. - R Wielokr. - R2 Skorygow - R2 SS - Model df - Model MS - Model SS - Reszta df - Reszta MS - Reszta F p Syn 0,498870 0,248871 0,204687 1,113387 1 3,360363 17 0,197668 5,632602 0,029684

Literatura Hallmann J, Quadt- Hallmann QA, Mahaffee WF and Kloepper JW (1997). Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol. 43:895–914. Jha, P.N., Gupta, G., Jha P.,  Mehrotra, R. (2013). Association of   rhizospheric/endophytic bacteria with plants: A potential gateway to sustainable agriculture. Greener J Agri. Sci. 3:73-84.  Backman PA and Sikora RA (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biol. Control. 46: 1– 3. Chu H, Fujii T, Morimoto S, Lin X, Yagi K, Hu J, Zhang J (2007) Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral fertilizer and organic manure in a sandy loam soil. Appl Environ Microb 73:485–491 Seghers, D., E. M. Top, D. Reheul, R. Bulcke, P. Boeckx, W. Verstraete, and S. D. Siciliano. 2003. Long-term effects of mineral versus organic fertilizers on activity and structure of the methanotrophic community in agricultural soils. Environ. Microbiol. 10:867-877. Dawkins, R. (1999). The Extended Phenotype. Oxford: Oxford University Press. De Deyn, G. B., Biere, A., Van Der Putten, W. H., Wagenaar, R., and Klironomos, J. N. (2009). Chemical defense, mycorrhizal colonization and growth responses in Plantago lanceolata L. Oecologia 160, 433–442. Baldani J.I., 2000. The sugarcane story – reasons for succes in Brazil. Proc. Int. Symp. on Nitrogen Fixation with non-legumes, Australia, 171. Gabryś Halina: Gospodarka azotowa W: Fizjologia roślin (red. Kopcewicz Jan, Lewak Stanisław). Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2002, s. 246-259. Backman, P.A and Sikora, R.A. (2008). Endophytes: An emerging tool for biological control. Biological Control 46: 1-3. Wilson, D. (1995). Endophyte – the evolution of a term, and clarification of its use and definition. Oikos 73, 274–276. Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). Immunolocalization of dinitrogenase reductase produced by Klebsiella pneumoniae in association with Zea mays L. Applied and Environmental Microbiology, 66(2), 783-787 http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/cm/management/2004/toxicosis/ http://aem.asm.org/content/76/5/1642.full http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Plant_endophyte