Dr Ewa Stępień Techniki biologii molekularnej Kurs doskonalący Diagnostyka Laboratoryjna 2010

Definicja Real-Time PCR Reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR) prowadzona w takich warunkach i przy zastosowaniu takich odczynników (znakowane fluorescencyjnie sondy lub barwniki specyficzne do dsDNA), które umożliwiają pomiar ilości narastającego produktu tej reakcji w dowolnym punkcie czasowym (w czasie rzeczywistym)

W przeciwieństwie do zwykłej in. konwen- cjonalnej reakcji PCR (end point PCR) w której analizie podlega ilość produktów reakcji PCR po ostatnim cyklu, w Real-Time PCR analizuje się przyrost produktów reakcji PCR po każdym cyklu reakcji.

Primery specyficzne dla danego genu: primers Sondy do analizy specyficznych fragmentów amplifikacji: probes Termostabilna polimeraza: polimeraza Taq o właściwościach egzo-nukleazy Substraty do syntezy produktow amplifikacji: dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP Jony Mg 2+ inne

Zaprojektowanie specyficznych primerów i amplikonów Primery pomijające sekwencje intronowe Baza genomu człowieka Pozyskanie RNA w odpowiedniej ilości i odpowiedniej jakości kopii/100ng RNA 100 ng RNA = 100 kopii trankryptu (średnio) Zanieczyszczenie DNA 1% Wykonanie reakcji odwrotnej trankrypcji Primery specyficzne genowo (tylko gdy używamy syntetycznego standardu) Oligo d(T)16 Randome hexamers

Zaprojektowanie specyficznych primerów i sond Bazy danych genomu człowieka Programy do konstrukcji primerów i sond Freeware: Shareware: Software

Organizm Szacunkowa wielkość genomu [bp] Szacunkowa liczba genów Średnia gęstość genu [bp] Diploidalna liczba chromosomów Człowiek2.9 x 10 9 ~30,0001/100,00046 Rattus norvegicus 2.8 x 10 9 ~30,0001/100,00042 Mysz2.5 x 10 9 ~30,0001/100,00040 Drosophila melanogaster 1.8 x ,6001/9,0008 Arabidopsis1.2 x ,5001/4,00010 Coenorabditis elegans 9.7 x ,1001/5,00012 Sacharomyces cerevisiae 1.2 x ,3001/2,00032 Escherihia coli4.7 x ,2001/14001 Haemofilus influenzae 1.8 x ,7001/10001

Prwidłowo zaprojektowany primer powinien charakteryzować się: Specyficzny do szukanej sekwencji DNA Długość primera ok bp Nie powinien tworzyć struktur drugorzeędowych (hairpin, primer-dimer) Unikać powtórzeń >3 zasad lub pod rząd Na końcu 3 zasada C lub G Nie jest znakowany fluorescencyjnie Daje produkt o długości bp ( bp SG) Temperatura anealingu: o C Temperatura topnienia primera (Tm – melting temperature) niższa o 5-10 o C niż temperatura sondy

Prawidłowo zaprojektowana sonda powinna charakteryzować się: Specyficzna do szukanej sekwencji DNA Długość sondy <30 bp Nie może zawierać G na 5 końcu (wygaszanie sygnału fluorescencji) Sekwencja targetowa sondy powinna zawierać między 30 a 80% zasad G/C Sekwencja sondy powinna zawierać więcej C niż G Temperatura topnienia sondy (Tm – melting temperature) wyższa o 5-10 o C niż temperatura primera Odpowiednio dobrane znaczniki fluorescencyjne: reporter-quencher

ReporterQuencher FAMBHQ1, DABCYL,TAMRA** TETBHQ1, DABCYL HEXBHQ1, BHQ2, DABCYL TAMRABHQ2, DABCYL Texas RedBHQ2, BHQ3, DABCYL ROXBHQ2, BHQ3, DABCYL* Cy5BHQ2, BHQ3

Sonda TaqMan

Molekularne beacons

Sondy hybrydyzacyjne

Singleplex amplifikacja jednej sekwencji przy użyciu jednej pary primerów (i jednej sondy) Multiplex amplifikacja wielu sekwencji tergetowych przy użyciu wielu par primerów i sondy Co nas ogranicza? Dostępność odpowiednich barwników Możliwości aparaturowe (źródło światła wzbudzenia – laser, lampa halogenowa; rozdzielczość detektorów – fotopowielacza, kamera CCD)

2a. excitation filters 2b. emission filters 1. halogen tungsten lamp 4. sample plate 3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels

Zużywa się mniej próbki na wykonanie oznaczeń Kontrola wewnętrzna amplifikacji (analiza wielu produktów w jednej próbce jednocześnie) – eliminacja fałszywie negatywnych próbek Znaczne zmniejszenie kosztów (mniej polimerazy, mniejsza ilość izolacji, mniej końcówek, naczynek reakcyjnych itp.) Zmniejszenie ryzyka kontaminacji ale: wyższe koszty początkowe, i trudniejsza optymalizacja metody

Powtarzalność i wydajność reakcji Real-Time PCR: C T zależy od ilości początkowego DNA w próbce Dobrze zoptymalizowany protokół Real-Time PCR pozwala na uzyskanie liniowej krzywej standardowej dla serii rozcieńczeń próbki wyjściowej

20

Próbka o znanej ilości DNA – standard (liczba kopii, ng) lub nie znanej ilości DNA (cDNA genu kontrolnego) Wykonanie serii rozcieńczeń (10x) Wykonanie amplifikacji w serii 3 powtotzeń dla każdego rozcieńczenia Odczytanie wartości C T dla każdego rozcieńczenia próbki (standardu) Wykreślenie krzywej standardowej dla wartości C T względem stężenia standardu przy użyciu modelu regresji liniowej Pearsona: R 2 > 0,980 lub r > 0,990

W idealnie dobranej reakcji, w fazie eksponencjalnej dochodzi do podwojenia ilości produktów reakcji PCR 2 n = 10 (wspołczynnik rozcieńczenia) n = 3,32 Oznacza to, że C T powinno być rodzielone dla poszczególnych rozcieńczeń o 3,32 cykle

Z parametrów regresji liniowej możemy odczytać, w jakim stopniu punkty doświadczalne uzyskane w wyniku analizy krzywej standardowej odpowiadają wartościom teoretycznym Wartości r i R2 mówią o powtarzalności oraz o wydajności metody dla różnych stężeń próbki R 2 > 0,980 lub r > 0,990 Wydajność amplifikacji E wylicza się z równania krzywej regresji liniowej, gdzie E=10 -1/tg %E = (E-1) x 100% Idealna wydajność amplifikacji wynosi 2

Wydajność bliska 2 (100%) jest najlepszym wyznacznikiem powtzrzalności metody Real- Time PCR w praktyce E wynosi od 95 do 105% Wartość < 95% spowodowana jest niewłaściwym doborem primerów, lub niezoptymalizowanymi warunkami reakcji Wartość > 105% jest spowodowana błędami przy pipetowaniu poszczególnych rozcieńczeń primerów lum niespecyficzną amplifikacją

Prawidłowo zaprojektowany profil termiczny reakcji Real-Time PCR powinien zawierać następujące punkty: Anealing, Extension

Decarboksylaza ornityny Antizyme inhibitor

Wartość C T b-aktynaODCAZIOAZ simplex17.0 ± ± ± ± 0.1 multiplex17.0 ± ± ± ± 0.2

Całkowita objętość próbki: μL PCR master mix Taq polimeraza 3,75 U/50 μL dNTPs od 200 μM do 400 μM MgCl 2 od 3,5 mM do 5,0 mM Próbka RNA od 100 pg do 100 ng Primery 300 nM Sondy 200 nM

Całkowita objętość próbki: μL PCR master mix Taq polimeraza 3,75 U/50 μL dNTPs od 200 μM do 400 μM MgCl 2 od 3,5 mM do 5,0 mM Próbka RNA od 100 pg do 100 ng Sybr Green I

Różnicowanie zmienności allelicznej dotyczącej mutacji punktowych w obrębie danego egzonu, tzw. alleli SNP - single nucleotide polymorphisms Metoda analizowania zmiennosci allelicznej pozwala na klasyfikację badanych próbek pod względem obecności danego allelu: Homozygoty (próbki które posiadają allele 1 lub allele 2) Heterozygoty (próbki które posiadają oba allele 1 i 2)

Allele występujące częściej w populacji, tzw. allel dzikie Allele występujące rzadziej w populacji, tzw. allele zmutowane lub polimorfizmy Polimorfizm gen reduktazy metyleno-tetrahydrofolianowej (MTHFR C677T) heterozygota MTHFR C677T, homozygota CC677, homozygota TT677 Mutacja gen czynnika V Leiden (FV G1691A), heterozygota FV G1691A, homozygota GG1691, homozygota AA1691 gen protrombiny (PT G20210A) ), heterozygota PT G20210A, homozygota GG20210, homozygota AA20210

Dyskryminację alleli oznacza się przy użyciu specyficznych sond znakowanych rożnymi barwnikami (VIC i FAM) odpowiednio dla danej mutacji. Czasem używa się więcej niż jednej pary primerów. Reakcje przeprowadza się w czasie rzeczywistym, natomiast analizuje się sygnał fluorescencji końcowej (end-point analysis).

Wykres zróżnicowania allelicznego na podstawie końcowej fluorescencji produktów amplifikacji Analiza SNP przy użyciu metody Taq Man Real-Time PCR

homozygota AA1691sonda dla allelu dzikiego FV1691 znakowana FAM homozygota AA1691 sonda dla mutacji FVA1691 znakowana TAMRA Homozygota AA1691

homozygota GG1691sonda dla allelu dzikiego FV1691 znakowana FAM homozygota GG1691 sonda dla mutacji FVA1691 znakowana TAMRA Homozygota GG1691

heterozygota G1691A sonda dla allelu dzikiego FV1691 znakowana FAM heterozygota G1691A sonda dla allelu zmutowanego FV1691 znakowana TAMRA Heterozygota G1691A

Zapis przyrostu fluorescencji dla kilku próbek DNA analizowanych w powtórzeniach, w jednym kanale fluorescencji. ΔRnΔRn cykle tło Faza eksponencjalna Faza liniowa Faza plateau

Mastermix 2.25 U iTaq DNA polymerase 200 μM każdego dNTP 3 mM MgCl 2 20 mM Tris-HCl, pH mM KCl 10 ng próbki DNA Primery 400 nM każdego primera Sondy: 400 nM każdej sondy Woda wolna od nukleaz do objętości 25.0 μl