Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka Produkt protoonkogenu c-mos częściowo degradowany po uwolnieniu z bloku metafazy drugiego podziału mejotycznego i utrzymywany podczas interfazy w zygocie myszy Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka

Wstęp

Badania na płazach W niezapłodnionych komórkach jajowych kregowców, cykl komórkowy jest zatrzymany w metafazie drugiego podziału mejotycznego (metafaza II) przez czynnik cytostatyczny CSF W metafazie II, kiedy CSF jest aktywny, aktywność MPF jest wysoka i pozostaje nienaruszona Oocyt zostaje uwolniony z bloku metafazowego po zapłodnieniu lub aktywacji Produkt protoonkogenu c-mos jest zaangażowany w aktywność CSF Bialko Mos jest obecne w dużych ilościach w oocycie w metafazie II i nie zostało wykryte w zapłodnionych komórkach Białko Mos może być degradowane po zapłodnieniu lub aktywacji przez proteazę kalpainową zależną od wapnia

Badania na myszach Działanie CSF nie zostało dowiedzione Wykazano, że blok metafazowy zależy od syntezy pewnych białek Zarówno c-mos mRNA jak i jego produkt (białko p39mos) są obecne w oocycie od wczesnych stadiów pęcherzyka zarodkowego do stadium metafazy II, kiedy to następuje zatrzymanie cyklu komórkowego Wstrzyknięcie do oocytu w stadium pęcherzyka zarodkowego c-mos-specyficznych antysensownych oligonukleotydów zapobiega wyrzuceniu I ciałka kierunkowego i przejściu do metafazy drugiego podziału mejotycznego

Materiały i metody 5-6 tygodniowym samicom myszy podano 5 IU oraz (48h później) hCG Owulowane oocyty uzyskano 14 i 16 h po podaniu hCG przez nakłuwanie ampuli jajowodów w roztworze hialuronidazy Oocyty zaktywowano 18 h po podaniu hCG przez 6,5 min.ekspozycję w 8% alkoholu Komórki hodowano w pożywce M2 pod parafiną w 37 0C Zapłodnione komórki jajowe uzyskano przez połączenie samic z samcami i wyizolowanie z jajowodów 25-27h po podaniu hCG Do obserwacji wczesnych etapów (wyrzucenie ciałka kierunkowego, formowanie przedjądrza) wybrano, ze względu na lepszą synchronizację, jaja aktywowane w alkoholu

Materiały i metody c.d Badano aktywność kinazy histonu H1(cdc2) (badanie aktywnosci MPF) w HK buforze przy użyciu egzogennych histonów H1. Odpowiednio przygotowane próbki poddano eloktroforezie na 15% żelu poliakrylamidowym Zaktywowane oocyty po wyrzuceniu ciałek kierunkowych poddano immunoprecypitacji używając przeciwciał skierowanych przeciwko cyklinie B. Próbki badano na 10% żelu poliakrylamidowym W celu stwierdzenia obecności produktu genu c- mos zastosowano immunoblotting

Wyniki

Aktywność kinazy histonu H1(cdc2) 1-oocyty w bloku metafazy II 2-oocyty zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego 3-oocyty 5-7 h po aktywacji (G1) 4-oocyty 13-15 h po zapłodnieniu (S)

Wniosek aktywność MPF (wyrażona aktywnością kinazy cdc2) spada gwałtownie po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

Degradacja cykliny B w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego 1-oocyty kontrolne 2-komórki tuż po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

Wniosek Ponad 65% cykliny B jest degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego

Eksperyment (immunoblot ) pokazujący obecność białka Mos w oocytach Rysunek lewy 1- 1500 oocytów w metafazie II: 2- 1500 oocytów we wczesnej interfazie (zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego): 3- 1500 oocytów w póżnej fazie G1: 4- 1500 oocytów w fazie S Rysunek prawy 125, 250, 500 ,750 oocytów w metafazie II

Spostrzeżenia Ilość Mos po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego jest podobna do ilości obserwowanej w metafazie II (87%) Ilość Mos w fazie G1 i w późnej fazie S znacznie się zmniejszyła (pozostało jedynie 23% białka obecnego w metafazie II)

Wniosek Białko Mos nie jest w znaczący sposób degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego => jest degradowane później, podczas fazy G1 Około 23% białka Mos nie jest degradowane i jest obecne podczas 1 cyklu mitotycznego w zygocie

Podsumowanie

U płazów, produkt protoonkogenu c-mos jest kluczowym katalitycznym komponentem CSF; celem kinazy Mos może być cyklina B, regulatorowa podjednostka MPF U myszy białko Mos jest syntetyzowane w dojrzewających oocytach, ale nie w zygocie; c-mos RNA jest degradowane podczas dojrzewania mejotycznego U obu gatunków, podczas zapłodnienia, CSF powinien być inaktywowany, żeby umożliwić dalszy rozwój => Nie ma jednak bezpośrednich dowodów, że CSF jest inaktywowany podczas wyjścia z bloku metafazy II

Istnieją dwie możliwości: 1.inaktywacja CSF jest konieczna do wyjścia z II podziału mejotycznego 2.aktywacja powoduje zniszczenie cykliny w sposób, który nie może być zablokowany przez aktywny CSF W 2. Przypadku destrukcja CSF ma miejsce póżniej, podczas pierwszego cyklu, i ten przypadek, jak wynika z badań, dotyczy myszy

Mos jest kluczowym, katalitycznym składnikiem czynnika cytostatycznego (CSF) => Istnieją dwie potencjalne możliwości inaktywacji CSF: 1.zmiana aktywności białka Mos 2.degradacja Mos przez proteazę kalpainową zależną od wapnia W 2.przypadku aktywacja proteazy mogłaby zachodzić w momencie napływu wapnia, który ma miejsce zaraz po zapłodnieniu.

Degradacja produktu c-mos ma miejsce po degradacji cykliny B i inaktywacji MPF. Jeśli inaktywacja CSF ma związek z destrukcją białka Mos oznacza to, że inaktywacja CSF nie jest konieczna do wyjścia z bloku metafazowego. Degradacja Mos podczas fazy G1 1.cyklu komórkowego zygoty może być konieczna, aby uniknąć bloku metafazowego podczas mitotycznych podziałów Jeśli inaktywacja CSF jest wymagana do wyjścia z bloku metafazy II, to nie ma ona związku z degradacją Mos, tylko raczej z mechanizmem regulacyjnym, który modyfikuje aktywność CSF (np. przez zmianę stanu fosforylacji Mos) 23% białka Mos obecnego w metafazie II jest w zygocie jeszcze w późnej fazie S (częściowo mogą to być nowo zsyntetyzowne białka, ponieważ pewne ilości c-mos mRNA są obecne na tym etapie) Niewielkie ilości Mos obecnego w zygocie mogą odgrywać rolę podczas przejścia z fazy G2 do M

Koniec