Oznaczenia oceniające gospodarkę węglowodanową: glukoza, HbA1c, albumina w moczu, ciała ketonowe

Cukrzyca to grupa chorób metabolicznych o różnej etiologii, charakteryzująca się przewlekłą hiperglikemią spowodowaną zaburzeniami wydzielania lub działania insuliny

Prawidłowy poziom glukozy na czczo w surowicy: dzieci-3. 5-5 Prawidłowy poziom glukozy na czczo w surowicy: dzieci-3.5-5.6 mmol/l dorośli-4.5-5.9 mmol/l

Kryteria diagnostyczne cukrzycy obejmują: 1 Kryteria diagnostyczne cukrzycy obejmują: 1.Glikemia na czczo (osocze krwi żylnej) > 7,0 mmol/l (126 mg/dl) 2.Glikemia przygodna oznaczona w osoczu > 11,0 mmol/l (200mg/dl) 3.OGTT po 2h > 11,0 mmol/l

Badania laboratoryjne w cukrzycy # Badania przesiewowe (dzieci, przyszli rodzice) # Diagnostyka w kierunku potwierdzenia cukrzycy # Diagnostyka w kierunku ustalenia typu cukrzycy # Badania w fazie ostrej cukrzycy # Monitorowanie leczenia osób z cukrzycą # Badania przesiewowe w kierunku powikłań cukrzycy # Diagnostyka w powikłaniach

Rola laboratorium w cukrzycy Faza przedkliniczna: # Markery genetyczne HLA # Markery immunologiczne przeciwciała przeciwko GAD, IAA, fosfatazie tyrozyny # Stężenie glukozy (metoda zautomatyzowana) # Stężenie insuliny (na czczo, OGTT) Faza kliniczna: # Stężenie glukozy # OGTT # Ciała ketonowe (krew, mocz) # Insulina, peptyd C, testy stymulacyjne Leczenie – faza ostra: # Stężenie glukozy (krew, mocz) # równowaga kwasowo-zasadowa # mleczany Leczenia – faza przewlekła: # Białka glikowane – HbA1c # Białka w moczu – wydalanie albumin  mikroalbuminuria, proteinuria # Lipidy, kreatynina

Metody oznaczania glukozy

Metoda z heksokinazą Glukoza pod wpływem heksokinazy ulega fosforylacji przy udziale ATP do glukozo- 6-fosforanu i ADP. Glukozo-6-fosforan jest utleniany do 6-fosfoglukonianu przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Powstaniu NADH towarzyszy wzrost absorbancji przy długości fali 340nm, który jest proporcjonalny do stężenia glukozy w badanej próbce. Metoda pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy krwi, osoczu i moczu. heksokinaza Glukoza +ATP G-6-P +ADP G-6-PDH (Dehydrogenaza G-6-P) G-6-P +NAD 6-PG +NADH +H

Metoda z oksydazą glukozy polega na przekształceniu glukozy przez oksydazę glukozową w kwas glukonowy przy jednoczesnym utworzeniu nadtlenku wodoru, a następnie, redukcji H2O2 przez peroksydazę w obecności o-dianizydyny (DH2), która ulega utlenieniu tworząc barwny produkt końcowy (związek D): oksydaza glukozy glukoza + H2O + O2 kwas glukonowy + H2O2 peroksydaza H2O2 + DH2 2H2O + D

Metoda z dehydrogenazą glukozy Dehydrogenaza glukozy glukoza+NAD D-glukozo-delta-lakton+NAD+H

Metoda o-toluidynowa gorący kw. octowy O-toluidyna+glukoza kompleks chromogenowy

Elektrochemiczny czujnik glukozy Czujnik ten stanowi elektroda tlenowa zawierająca odpowiedni enzym w części receptorowej. Enzymem tym jest -oksydaza glukozowa, która katalizuje reakcję utleniania glukozy. Tak skonstruowaną elektrodę tlenową uczuloną enzymatycznie zanurza się w roztworze nasyconym tlenem z powietrza i rejestruje prąd początkowy. Po wprowadzeniu do badanego roztworu glukozy część tlenu dyfundującego do katody jest zużywana w reakcji utlenienia glukozy z wykorzystaniem immobilizowanego enzymu zgodnie z reakcją. W wyniku tego procesu zmniejsza się koncentracja tlenu w roztworze i maleje strumień jego dyfuzji w kierunku powierzchni katody. Gdy procesy na elektrodzie osiągną stan ustalony, wówczas rejestruje się prąd końcowy. Obserwowany spadek natężenia prądu jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy.

Glukometr Przeprowadzenie pomiaru polega na pobraniu kropli krwi (najczęściej z palca), naniesieniu jej na test paskowy umieszczony w aparacie i odczytaniu wyniku. Dostępne na rynku glukometry mierzą stężenie glukozy za pomocą jednej z dwóch metod: fotochemicznej i elektrochemicznej. Metoda fotochemiczna, nazywana również reflektometryczną, polega na rejestrowaniu ilości odbitego światła, zależnego od zmiany zabarwienia pola testowego, natomiast metoda elektrochemiczna mierzy natężenie mikroprądu elektrycznego przepływającego przez pole reaktywne testu paskowego (pod wpływem glukozy zachodzi tam enzymatyczna reakcja chemiczna) Celem glukometrii jest monitorowanie stopnia wyrównania glikemii u chorych na cukrzycę, a nie diagnostyka !!!

1 etap – reakcja enzymatyczna 2 etap – pomiar fotometryczny lub elektrochemiczny

Hemoglobina glikowana

Hemoglobina glikowana - mieszanina kilku różnych pochodnych powstających w wyniku reakcji glukozy lub innych węglowodanów z wolnymi grupami aminowymi dostępnymi na powierzchni makrocząsteczki Hb; glukoza przyłącza się do waliny N-końcowego fragmentu łańcucha β. HbA1c służy do oceny poziomu glikacji w celu monitorowania leczenia cukrzycy. Metodą referencyjną oznaczania glikowanej HbA1c jest metoda HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)

Metody oznaczania

Metodą referencyjną oznaczania glikowanej HbA1c jest metoda HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa) Wykonanie: 1. rozpuszczoną próbkę w rozpuszczalniku nakłada się na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym 2. zachodzą oddziaływania pomiędzy próbką a wypełnieniem kolumny i następuje rozdział

Inne metody: # izoelektroogniskowanie # spektrofotometria # spektroskopia masowa # met. immunochemiczne

Czynniki interferujące z metodami oznaczania glikowanej Hb: # HbS, HbC, HbF # pH, molalność, temperatura # mocznica, żółtaczka, lipemia, niedokrwistość, ciąża # penicylina, aspiryna, witamina C # Wiek # Rasa

Ocena wartości HbA1: norma / cukrzyca wyrównana 5,5 – 8% dobrze wyrównana cukrzyca 8 – 10% częściowo wyrównana cukrzyca 10 – 12% niewyrównana cukrzyca 12%

kwas β-hydroksymasłowy (stanowi najwyższą frakcję) Ciała ketonowe aceton  kwas acetylooctowy kwas β-hydroksymasłowy (stanowi najwyższą frakcję)

W przypadku cukrzycy, gdy wystąpi brak insuliny, jako alternatywne źródło energii rozkładane są tłuszcze, a efektem ubocznym tego jest nadmierne gromadzenie ketonów we krwi. Nadmiar ketonów we krwi jest przyczyną kwasicy ketonowej. Organizm próbuje pozbyć się ich przez intensywne wydalanie z moczem lub przez płuca

Metody oznaczania

  Ciała ketonowe w moczu oznacza się przy użyciu pasków testowych, metodą opartą na reakcji acetonu i kwasu acetooctowego z nitroprusydkiem sodu i glicyną w środowisku alkalicznym, w wyniku której powstaje barwne kompleksowe połączenie. Ma ona charakter półilościowy, ze wzrokową lub reflektometryczną (czytniki pasków) oceną zmiany barwy pola reakcyjnego. Metoda ta nie pozwala na wykrycie kwasu beta-hydroksymasłowego, stanowiącego największą frakcję ciał ketonowych. Badanie powinno się wykonywać w niedawno oddanej próbce moczu. Wyniki fałszywie dodatnie mogą wystąpić u chorych zażywających leki zawierające grupy sulfhydrylowe.Na wyniki fałszywie ujemne może wpływać obecność w dużych stężeniach kwasu askorbinowego w moczu. 

 Podstawą ilościowego oznaczania stężenia kwasu beta-hydroksymasłowego w osoczu lub w pełnej krwi włośniczkowej jest reakcja utleniania kwasu beta-hydroksymasłowego do acetooctowego, katalizowana przez swoisty enzym, dehydrogenazę kwasu beta-hydroksymasłowego (beta-HBDH), z odczytem spektrofotometrycznym lub amperometrycznym. Badanie to ma przewagę nad oznaczaniem kwasu acetooctowego w moczu w rozpoznawaniu i monitorowaniu przebiegu cukrzycowej kwasicy ketonowej.

Albumina w moczu Pojawia się, gdy u osób chorujących na cukrzycę dochodzi do uszkodzenia nerek Mikroalbuminuria jest wczesnym markerem nefropatii cukrzycowej i nadciśnieniowej niestety jest ona niewykrywalna rutynowym paskiem testowym (próg detekcji ok. 200-250 mg/l) Albuminę w moczu można zmierzyć metodą RIA albo HPLC

Dziękuję