Rozpraszanie światła

Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm) strumień fotonów

Natura falowa światła Ez(t)=Eosin(2πυt-ky) Hx(t)=Hosin(2πυt-ky) Eo,Ho - amplitudy υ - częstotliwość k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa

Natura falowa światła w liczbach: prędkość światła c = 2,9979×108m/s długość fali λ = (390 - 780)nm (1 nm = 10-9m = 10 Å) częstotliwość υ = (7,7 - 3,8)×1014 Hz (fioletowe-czerwone) liczba falowa (częstość υ = 1/λ) 25000-13000 cm-1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-10000Å (1-1000 nm)

Natura korpuskularna światła promieniowanie EM jest strumieniem fotonów E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemoglobina ma kolor czerwony! - silnie absorbuje promieniowanie żółte, zielone i niebieskie a przepuszcza czerwone Zaabsorbowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3,61×10-19J

Rozpraszanie światła http://www.wyatt.com/theory/ Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność

Cechy promieniowania rozproszonego Intensywność (natężenie), I ~ Eo2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I ~ λ-4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstość: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne

Dlaczego niebo jest niebieskie?

Dlaczego niebo jest niebieskie! (700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

Rozpraszanie w roztworze v-mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, ki , ks – wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego Es, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, ki i ks są sobie równe, |q| = |ki ­ ks| = 4n/sin(/2).

Częstotliwość światła rozproszonego równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie- zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki !!Ale zmiana częstotliwości może wyniknąć z ruchu cząsteczek rozpraszających - efekt Dopplera

Zmiana częstotliwości

Widmo światła rozproszonego

Fluktuacje natężenia

Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) - SLS Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry-Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego (rozpraszanie dynamiczne) - DLS lub spektroskopia korelacji fotonów                                                               

Układ pomiarowy

Rozpraszanie promieniowania przez roztwory Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): gdzie: RΘ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa)

Indykatrysy rozpraszania światła Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d <<  Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d  

Efekt interferencji wewnętrznej - spojrzenie I E1 = eikR Wektor falowy q = 0 Dj = 0 k = 2  n /  E2 = eikR Wektor rozpraszania q = 4  n/ sin /2 q = 2 k sin /2 Dj q q  0 Dj = k d sin  d E1 = eikR1 E2 = eikR2

Efekt interferencji wewnętrznej - spojrzenie II E1 = eikR Dj q = 180° Dj = 2 k d E2 = eik(R+2d) E1 = eik(R+d) q = 0° Dj = 0 E2 = eik(R+d)

Rozpraszanie statyczne w roztworze q2 tg  = 1/3 q2 Rg2

Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm

Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R siła jonowa                                   1/M c

radial distribution function (-> theory)

Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera t g(t) w I widmo natężenie funkcja korelacji

Spektroskopia Korelacji Fotonów (Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do badań submikrosopowych obiektów biologicznych. Co można zmierzyć: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT): makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe), biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki) G(t) = <I(0)I(t)> g(2)(t) = 1 + exp(-2 q2 DTt).

Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) Pomiar DT - informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego kula elipsoida obrotowa pałeczka „model kulkowy” DT = kBT/(6Rh)

Spektroskopia Korelacji Fotonów 2. Z zależności DT od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między obiektami. odpychanie kompensacja przyciąganie c DT

Kula -najprostszy model hydrodynamiczy DT = kT/(6πηRH) RH Interpretacja np. współczynnika dyfuzji (+) Rozmiar (?) Kształt (?) Upakowanie (?) Hydratacja

Rh = [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Kombinacja RH z v2 i δ1v1 Vo = (Mw/NA)v2  (objętość „suchego” białka) VH2O = δ1 (Mw/NA)v1 (objętość dołączonej wody) Vh = Vo = VH2O    (objętość hydratowanego białka) Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1) v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie sekwencji] δ1 - hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji] v1 – objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = 0.9058(cm3/g) RH = Rh F

Lizozym - model elipsoidy

L d Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej)

Kombinacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne informacje DT - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna liczba lepkościowa Mw (masa), RH, Rg (rozmiar), υ1, ρ (objętość właściwa, hydratacja) a/b (kształt) giętkość stopień asocjacji

Kombinacja parametrów DT i DR (lub τ ) S i DT DT i [η] DT i Rg p=b/a lub p=L/d + informacje o objętości właściwej i hydratacji

Proste modele hydrodynamiczne elipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b) BPTI elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b) pałeczka (cylinder) (p=L/d) aktyna 20mer DNA

Modele kulkowe Wymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii) i (F = -fv) , i = 1, 2, ..., N vi DT = kT -1 Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm HI4 (R. Pastor - u autora)

Różne typy modeli kulkowych a) b) c) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulka-aminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.

Model „powłokowy” Kulka na atom pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model)

Kulka na aminokwas

Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd

Zastosowania modelu kulkowe - celulaza Kombinacja parametrów hydrodynamicznych z danymi krystalograficznymi, NMR i symulacją MC

Symulacja Rozkład współczynników dyfuzji dla modelu kulkowego giętkiego łącznika polipeptydowego. Rozmiar kulek  = 4.5 Å.

Wyniki symulacji a) Rozkład odległości między środkami domen dla celulazy b) zależność współczynnika dyfuzji od odległości między domenami, pozioma linia określa wyznaczony eksperymentalnie współczynnik dyfuzji, któremu odpowiada szeroki przedział konformacji modelu. a) b)

Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT), Promień hydrodynamiczny (Rh), Liczba składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgań wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu – pomiary kątowe).

Koniec