Immobilizacja biokatalizatorów

Metody unieruchamiania (Kourkoutas i in Metody unieruchamiania (Kourkoutas i in. Food Microbiology 24, 2004, 377-397)

Immobilizacja enzymów

Właściwości fizyczne nośników ceramicznych Średnica porów (średnia) [nm] Średnica porów (minimalna) [nm] Średnica porów (maksymalna) [nm] Powierzchnia właściwa [m2/g] SiO2 51 35 68 50 Al2O3 17,5 14 22 100 44%TiO2 + 56% Al2O3 30 75 TiO2 40 48

Immobilizacja -amylazy na szkle porowatym - optimum aktywności symbole pełne – enzym immobilizowany symbole puste – enzym wolny Wykresy dotyczą alfa-amylazy

Immobilizacja -amylazy na szkle porowatym - optimum stabilności symbole pełne – enzym immobilizowany symbole puste – enzym wolny Enzym przetrzymywano w danej temperaturze w czasie 1 godziny

Immobilizacja -amylazy na szkle porowatym - optimum aktywności symbole pełne – enzym immobilizowany symbole puste – enzym wolny

Immobilizacja -amylazy na szkle porowatym - optimum stabilności symbole pełne – enzym immobilizowany symbole puste – enzym wolny Enzym przetrzymywano w danym pH w czasie 1 godziny

Metody aktywacji powierzchni nośników nieorganicznych silanizacja

Silanizacja c.d.

Aktywacja powierzchni nośników nieorganicznych c.d.

Eupergit® C– nowy aktywny nośnik do immobilizacji enzymów (Katchalsky-Katzir i Kraemer, 2000, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 10, 157-176)

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – trwałość enzymu N – enzym (acylaza penicylinowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI Enzym przechowywano w buforze w pH 6,8, nośnik akrylowy, związanie aldehydem glutarowym

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – termostabilność enzymu N – enzym (acylaza penicylinowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI Enzym inkubowano w danej temperaturze przez 1 godzinę

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – optimum temperaturowe enzymu N – enzym (acylaza penicylonowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – odporność na skrajne warunki pH N – enzym (acylaza penicylonowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – optimum pH N – enzym (acylaza penicylonowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – kinetyka reakcji N – enzym (acylaza penicylonowa) natywny; Z – enzym związany, R - enzym stabilizowany PEI Kinetyka taka sama, zatem brak oporów dyfuzyjnych

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – optymalizacja immobilizacji Nośniki: I – żel krzemionkowy aktywowany grupami epoksydowymi; IV Kopolimer akrylowy aktywowany etylenodiaminą Właściwa immobilizacja enzymu polega stworzeniu warunków zbliżonych do naturalnych. Istotna rolę odgrywa obecność jonów Aktywność peroksydazy kapusty I - Enzym unieruchamiano na żelu krzemionkowym z grupami epoksydowymi - nośnik hydrofobowy – nieaktywny lub dezaktywujacy IV - Enzym unieruchamiano na kopolimerze akrylowym z grupami aminowymi z etylenodwuaminy – nośnik hydrofilowy aktywujący

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – optymalizacja immobilizacji Nośniki: I – żel krzemionkowy aktywowany grupami epoksydowymi; IV Kopolimer akrylowy aktywowany etylenodiaminą

Kowalencyjne wiązanie enzymów z nośnikiem – optymalizacja immobilizacji Wpływ serynowej proteinazy kapusty na aktywność peroksydazy kapusty a - enzym natywny b – enzym immoblizowany Inne obecne enzymy wpływają na enzym główny. Kompleks enzymów to naturalny układ W krótkich czasach inkubacji do 60 min serynowa proteinaza kapusty uaktywnia peroksydazę, potem to zanika. Pod wpływem serynowej proteinazy kapusty zmienia się optimum pH peroksydazy. Natywna z 6-7 na 9-10, a dla immobilizowanej są dwa optima pH=4 i pH=10-11

Kowalencyjne związanie komórek z nośnikiem - Wydajność immobilizacji Sacchcaromyces carlbergensis symbole pełne – krzemionka nieaktywowana symbole puste – krzemionka aktywowana Kowalencyjne wiązanie z nośnikiem stosuje się głównie dla enzymów Dla nieaktywowanej krzemionki wydajność immobilizacji spada ze wzrostem powierzchni właściwej Po aktywacji aldehydem glutarowym tendencja się odwraca

Usieciowanie – mechanizm reakcji z aldehydem glutarowym Świeżo destylowany aldehyd glutarowy jest gorzej reaktywny. Dlatego sugerowany mechanizm reakcji z obecnymi w technicznym aldehydzie glutarowym α,β-nienasyconych oligomerów

Alginian liniowe kopolimery blokowe lub naprzemienne kwasu glukuronowego i malunurowego

Struktura alginianu

Struktura komplesku alginianowo-wapniowego

Karagenian produkty izolowane przez alkaliczną ekstrakcję z morskich wodorostów (Rhodophycae) liniowe polimery galaktozy o różnym stopniu podstawienia grupami siarczanowymi

Agar izolowane podobnie jak karagenian przez ekstrakcję z morskich wodorostów (Rhodophycae) Mieszanina agarozy i agaropektyny, polimerów galaktozy – nie zawiera ugrupowań siarczanowych

Chitozan

Mikrokapsułki alginianowo-chitozanowe (Taqieddin i Amiji, 2004, Biomaterials 25, 1937-1945)

Hydroliza kazeiny c.d. chitosan alginian karagenian Alginian najlepszy nośnik bo najwięcej mieszaniny tyrozyny i tryptofanu się uwalnia 0,5, 1,0 1,5 i 2,0 % to stężenia kazeiny

Immobilizacja mikroorganizmów

Adhezja mikroorganizmów – tworzenie biofilmu Biofilm Escherichia coli

Tworzenie biofilmu

Teoria DLVO c.d.

Kolonizacja powierzchni przez mikroorganizmy

Kolonizacja powierzchni przez mikroorganizmy c.d.

Adhezja mikroorganizmów

Ściany komórkowe

Adhezja mikroorganizmów

Biofilm

Usuwanie biofilmów

Usuwanie biofilmów c.d.

Złoża biologiczne

Złoża biologiczne

Flokulacja mikroorganizmów – tworzenie kłaczków osadu czynnego

Usieciowanie mikroorganizmów– wykorzystuje się budowę ścian komórkowych

Usieciowanie aldehydem glutarowym

Biokonwersja D-sorbitolu do L-sorbozy

Biokonwersja D-sorbitolu do L-sorbozy wielokrotna biokonwersja przy użyciu komórek immobilizowanych w alginianie

Otrzymywanie kwasu propionowego Jasne słupki – Propionibacterium freudenreichi; Ciemne słupki – Propionibacterium shermanii; 1 1 – komórki wolne 2-9 – rosnące stężenia żelu alginianowego