Rozpraszanie światła

Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm) strumień fotonów

Natura falowa światła Ez(t)=Eosin(2πυt-ky) Hx(t)=Hosin(2πυt-ky) Eo,Ho - amplitudy υ - częstotliwość k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa

Natura falowa światła w liczbach: prędkość światła c=2,9979×108m/s długość fali λ=(390 - 780)nm (nm = 10-9m = 10Å) częstotliwość υ = (7,7 - 3,8)×1014 Hz (fioletowe-czerwone) liczba falowa (częstość υ =1/λ) 25000-13000 cm-1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-100Å (1-10 nm)

Natura korpuskularna światła promieniowanie EM jest strumieniem fotonów E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemoglobina ma kolor czerwony! - silnie absorbuje promieniowanie żółte, zielone i niebieskie a przepuszcza czerwone Zaabsorbowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3,61×10-19J

Rozpraszanie światła http://www.wyatt.com/theory/ Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność

Cechy promieniowania rozproszonego Intensywność (natężenie), I I ~ Eo2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I ~ λ-4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstość: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne

Dlaczego niebo jest niebieskie?

Dlaczego niebo jest niebieskie! (700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

Dlaczego niebo jest niebieskie! (700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

Rozpraszanie w roztworze v-mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, ki , ks – wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego Es, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, ki i ks są sobie równe, |q| = |ki ­ ks| = 2n/sin().

Częstotliwość światła rozproszonego równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie- zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki !!Ale zmiana częstotliwość może wyniknąć z ruch cząsteczek rozpraszających - efekt Doplera

Zmiana częstotliwości

Widmo światła rozproszonego

Fluktuacje natężenia

Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) – SLS (Statyczne Rozpraszanie Światła) Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry-Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lub PCS (Dynamiczne Rozpraszanie Światła lub Spektroskopia Korelacji Fotonów)                                                               

Układ pomiarowy próbka λ, Ii laser θ I Ist - standard (benzen, toluen) detektor Io - rozpuszczalnik (buffor) I - roztwór (białka, DNA, etc.) q =  2n/sin()

Układ pomiarowy

Rozpraszanie promieniowania Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): gdzie: RΘ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa)

Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R siła jonowa 1/M c P(q)  1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe) S(q)  interferencje międzycząsteczkowe

Indykatrysy rozpraszania światła – I(θ)  P(q) Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d <<  Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d  

Rozpraszanie statyczne w roztworze I(θ)  P(q) tg  = 1/3 q2 Rg2 P(q)  interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~ Rg

Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm

Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera t g(t) w I widmo natężenie funkcja korelacji

G(t) = <I(0)I(t)> Spektroskopia Korelacji Fotonów (Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do badań submikrosopowych obiektów biologicznych. Co można zmierzyć: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT): makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe), biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki) G(t) = <I(0)I(t)> g(2)(t) = 1 + exp(-2 q2 DT).

Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) Pomiar DT - informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego kula elipsoida obrotowa pałeczka „model kulkowy” DT = kBT/(6RH)

Spektroskopia Korelacji Fotonów Z zależności DT od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między obiektami. DT odpychanie kompensacja przyciąganie c

Kula -najprostszy model hydrodynamiczy DT = kT/(6πηRH) RH Interpretacja np. współczynnika dyfuzji (+) Rozmiar (?) Kształt (?) Upakowanie (?) Hydratacja

Rh = [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Kombinacja RH z v2 i δ1v1 Vo = (Mw/NA)v2  (objętość „suchego” białka) VH2O = δ1 (Mw/NA)v1 (objętość dołączonej wody) Vh = Vo = VH2O    (objętość hydratowanego białka) Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1) v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie sekwencji] δ1 - hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji] v1 – objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = 0.9058(cm3/g) RH = Rh F

Lizozym - model elipsoidy

L d Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej)

Kombinacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne informacje DT - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna liczba lepkościowa Mw (masa), RH, Rg (rozmiar), υ1, ρ (objętość właściwa, hydratacja) a/b (kształt) giętkość stopień asocjacji

Kombinacja parametrów DT i DR (lub τ ) S i DT DT i [η] DT i Rg p=b/a lub p=L/d + informacje o objętości właściwej i hydratacji

Proste modele hydrodynamiczne elipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b) BPTI elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b) pałeczka (cylinder) (p=L/d) aktyna 20mer DNA

Modele kulkowe Wymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii) i (F = -fv) , i = 1, 2, ..., N vi DT = kT -1 Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm HI4 (R. Pastor - u autora)

Różne typy modeli kulkowych a) b) c) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulka-aminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.

Model „powłokowy” Kulka na atom pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model)

Kulka na aminokwas

Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd

Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT), Promień hydrodynamiczny (Rh), Liczba składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgań wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu – pomiary kątowe).

Koniec  Zadania