Rybozymy Enzymologia-12 RNA - nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej

Historia … 1982:Self-splicing in Tetrahymena pre-rRNA (group I intron) Kruger et al, and Cech, Cell 31, (1982) 1983:RNAse P is a ribozyme Guerrier-Takada et al, and Altman, Cell, 35, (1983)

Właściwości RNA umożliwiające katalizę enzymatyczną Możliwości tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez parowanie krótkich odcinków w obrębie cząsteczki. Tworzenie niestandardowych par zasad np.: G U Obecność grupy hydroksylowej przy węglu 2` rybozy. Możliwość koordynacji kationów metali dwuwartościowych.

Efektywność katalityczna rybozymów - Kinetyka Michaelis-Menten E + SES E + P k1k1 k2k2 k-1k-1 Km=Km= k -1 + k 2 k1k1 = M k cat = min -1 k cat / K m = M -1.min -1 Bardzo dobra wydajność katalityczna!! Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy M -1 s -1 osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalityczna jest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

Rodzaje znanych rybozymów

Katalizowana reakcja RybozymAktywność małe rybozymy (typu Hammerhead, Hairpin, HDV) Autokatalityczne rozcięcie przez transestryfikację Introny grupy I, IIAutokatalityczne wycinanie intronów przez transestryfikację RNaza PUczestniczy w procesach dojrzewania tRNA SpliceosomUczestniczy w procesach dojrzewania mRNA Rybosom (23S rRNA)Tworzenie wiązań peptydowych

Właściwości i pochodzenie rybozymów naturalnych. Hammerhead, Hairpin, VS i HDV są rybozymami występującymi w wirusach i katalizują reakcję specyficznego (uzależnionego od sekwencji) przecięcia nici RNA uczestnicząc w procesie namnażania się wirusa. RNAza P jest nukleoproteiną, w której RNA tworzy centrum katalityczne reakcji, a białko odpowiada za utrzymanie RNA w aktywnej konformacji. Jedynie 23S rRNA rybosomu przeprowadza odmienną reakcję – tworzenie wiązania peptydowego.

Reakcja katalizowana przez małe rybozymy (hammerhead, hairpin, delta i NeurosporaVS). Wewnątrzcząsteczkowy transfer grupy fosforylowej Reakcja katalizowana przez introny grupy I i II oraz RNAzę P RNA Atak nukleofilowy egzogennej grupy hydroksylowej

małe RNA typu hammerhead, hairpin, rybozym delta - rybozymy degradujące wiązanie internukleotydowe w RNA z utworzeniem 2 3-cyklicznego fosforanu introny grupy I i II, RNA M1 - rybozymy degradujące wiązanie internukleotydowe w RNA z utworzeniem produktu niosącego grupę fosforanową przy końcu 3 Produkt reakcji …

Kwasy i zasady Lewisa w cząsteczkach rybozymów - porównanie z enzymami białkowymi. W przypadku enzymów białkowych resztą aminokwasową pełniącą rolę kwasu lub zasady Lewisa jest najczęściej histydyna, której pKa~7, co oznacza, że w pH=7 w przybliżeniu tyle samo cząsteczek jest zjonizowanych (i ma właściwości kwasowe), co niezjonizowanych (z właściwościami zasadowymi).

Porównanie pK a zasad azotowych z pK a grup bocznych aminokwasów

Małe rybozymy

Rybozymy typu Hammerhead

Ogólny mechanizm reakcji transestryfikacji katalizowanej przez rybozym typu Hammerhead

Rola jonów metali Obecność dwuwartościowych jonów metali (Mg 2+, Mn 2+, Ca 2+ ) jest konieczna dla aktywności rybozymu, jony biorą bezpośredni udział w katalizowanym przez rybozym cięciu RNA i/lub stabilizują formę przejściową reakcji. Nie wszystkie małe rybozymy wymagają obecności jonów metali dla swojej aktywności.

Struktura krystaliczna rybozymu typu Hairpin

Ogólny mechanizm reakcji transestryfikacji katalizowanej przez rybozym typu Hairpin

Struktura rybozymu typu Hairpin hairpin rybozym Ruppert et al, Nature 2001, Science 2002

Ruppert et al, Nature 2001 Ruppert et al, Science 2002 Forma przejściowaRybozym Hairpin

Ruppert et al, Science 2002 Forma przejściowa

Kataliza kwasowo-zasadowa jak w RNazie A?

Bevilacqua, Biochemistry 2003 G8 jako zasada A38 jako kwas

Introny grupy I i II Autokatalityczne wycinanie intronów przez transestryfikację – autokatalityczny splicing RNA

Intron grupy IIntron grupy II Występowanie Szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, splicing prekursorowego rRNA, mRNA w jadrze komórkowym, organellach, odkryte również w bakteriofagu T4 Rzadziej spotykane, głównie w mitochondriach grzybów i roślin, splicing pre-mRNA Centrum aktywne Miejsce katalityczne tworzy sam intron Reszta katalityczna Jednostką atakującą miejsce splicingowe 5 jest kofaktor guanozynowy Jednostką atakującą miejsce splicingowe 5 jest 2-hydroksyl specyficznej reszty adenylanowej intronu Powstały produkt Liniowe RNAIntron uwalniany w kształcie lassa jak w spliceosomie Aktywność in vitro Wykazują wysoką aktywność katalityczną in vitro Aktywność katalityczna 10x mniejsza in vitro, katalizują reakcję w warunkach ekstremalnych (100 mM MgCl 2, 500mM siarczan amonu, 45°C)

Struktura autokatalitycznego intronu z prekursora 23S rRNA Tetrahymena, wycinającego się bez pomocy białek Mechanizm autokatalitycznego splicingu

Splicing pre-mRNA – intron grupy II

Rola jonów Mg 2+

Prawdopodobna rola jonów Mg 2+ (a)-kataliza kwasowa (b)-kataliza zasadowa (c)-kwas Lewisa stabilizujący grupę odchodzącą (d)-kwas Lewisa umożliwiający atak nukleofilowy Takagi, Y. et al. Nucl. Acids Res. 29, (2001)

Rybonukleaza P Zbudowana z cząsteczki RNA o długości 377 nukleotydów (RNA M1) oraz białka o masie cząsteczkowej 20 kDa. Za aktywność katalityczną odpowiedzialna jest cząsteczka RNA M1 (1983 rok). Białko odgrywa rolę pomocniczą – zwiększa szybkość reakcji hydrolizy w niskich stężeniach jonów Mg 2+.

Utworzone zostają dojrzałe końce 5 tRNA

Krystaliczna struktura RNazy P RNA z B. stearothermophilus (Kazantsev et al., PNAS,2005)

Transferaza peptydylowa dużej podjednostki rybosomu Centrum reakcji tworzenia wiązania peptydowego jest cząsteczka 23S rRNA. Pomimo, że za katalityczną aktywność transferazy odpowiada RNA, nie udało się jeszcze skonstruować cząsteczki 23S rRNA, która wykazywałaby aktywność w nieobecności towarzyszących białek. Niezbędna do aktywności katalitycznej okazała się sekwencja CCA na 3` końcu cząsteczek tRNA, a w szczególności adenina.

Funkcja katalityczna: A2451 G2061 G2447