Przemysłowe wytwarzanie białek wytwarzanie przeciwciał hodowle komórek ssaków

Komórki uczestniczące w odpowiedzi immunologicznej

Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego

Mechanizm odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego

Rodzaje immunoglobulin Inne rodzaje: IgD i IgE – wielkość jak IgG

Podstawowa struktura immunoglobuliny G (IgG) H – łańcuchy ciężkie; L – łańcuchy lekkie; Fab – region wiążący antygen; Fc – region krystalizowalny

Struktura immunoglobuliny typu G VH, VL – domeny zmienne; CH1, CH2, CH3 – domeny stałe

Obszary domen zmiennych IgG VH – region zmienny łańcucha ciężkiego; VL – region zmienny łańcucha lekkiego; CDR (complementarity determining regions) – trzy obszary determinujące komplementarność oddziaływania z antygenem; FR (framework regions) – cztery częściowo konserwatywne fragmenty w obszarze zmiennym

Funkcjonalne fragmenty molekuły IgG

Rekombinacja genów kodujących fragmenty łańcuchów Ig w komórkach prekursorowych limfocytów B

Immunodiagnostyka Zasada trójetapowej procedury ELISA z wykorzystaniem dwóch przeciwciał

Immunocytochemia Zastosowanie chromogennych monoklonalnych przeciwciał do różnicowego wybarwiania elementów komórek

Immunocytochemia Zastosowanie chromogennych monoklonalnych przeciwciał do różnicowego wybarwiania elementów komórek. Analiza cyklu komórkowego

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu komórek hybrydowych Zasada metody

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu komórek hybrydowych

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu komórek hybrydowych Produkcja przeciwciał przez zwierzęta immunizowane antygenem

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu metody ekspozycji bibliotek fagowych Schemat otrzymywania biblioteki fagów prezentujących regiony zmienne ludzkich immunoglobulin

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu metody ekspozycji bibliotek fagowych Zasada metody

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu myszy transgenicznych Schemat otrzymywania myszy transgenicznych wytwarzających ludzkie przeciwciała

Przykłady biofarmaceutyków zawierających przeciwciała lub ich fragmenty Muromonab-CD3 Mysie przeciwciało monoklonalne wobec antygenu CD3 ludzkich komórek T. Wiąże się z glikoproteiną 20 kDa występująca na powierzchni limfocytów T. Zastosowanie: środek immunosupresyjny dla pacjentów po przeszczepach narządów. 2. Etanercept (Enbrel) Białko fuzyjne składające się z fragmentu wiążącego ligand pochodzącego z receptora ludzkiego czynnika matwicy nowotworu (TNFR), związanego z komponentem Fc ludzkiej IgG, zawierającego domeny CH2 i CH3 oraz region zawiasowy, ale nie domenę CH1. Wytwarzanie: komórki CHO w hodowli. Zastosowanie: Redukcja objawów ostrego reumatoidalnego zapalenia stawów. 3. Gentuzumab Ozogamicin (Mylotarg) Immunotoksyna. Połączenie rekombinowanej, humanizowanej IgG z cytoksycznym antybiotykiem przeciwnowotworowym, kalicheamycyną. Regiony stałe zawierają sekwencje ludzkie, natomiast regiony zmienne pochodzą z przeciwciała mysiego, rozpoznającego białko CD53. Zastosowanie: leczenie ostrej białaczki szpikowej CD53*.

Przykłady biofarmaceutyków zawierających przeciwciała lub ich fragmenty 4. Palivizumab (Synagis) Humanizowane przeciwciało monoklonalne IgG rozpoznające epitop we fragmencie atygenowym A białka F otoczki wirusa RSV. Sekwencja ludzka w 95% i mysia w 5%. Zastosowanie: leczenia ostrych infekcji dolnych dróg oddechowych u dzieci, wywołanych przez wirusa RSV. 5. ABCIXIMAB (ReoPro) Fragment Fab chimerycznego mysiego/ludzkiego przeciwciała rozpoznającego glikoproteine białka receptorowego na powierzchni ludzkich pytek krwi. Wytwarzane metod perfuzyjną w hodowli komórkowej. Zastosowanie: Lek zapobiegający tworzeniu skrzepów u pacjentów z niestabilną choroba wieńcową, u których przewiduje się wykonanie zabiegu operacyjnego w ciągu 24 h. 6. Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin) Immunokoniugat mysiego przeciwciała rozpoznającego antygen CD20 na powierzchni zmienionych nowotworowo limfocytów B z tiuksetanem, selektywnym chelatorem Indu-111 oraz Itru-90. Wytwarzanie: komórki CHO. Zastosowanie: Leczenie niektórych typów białaczek. Lek jest podawany po uzupełnieniu o radioaktywne izotopy.

Hodowle tkankowe komórek ssaczych Schemat budowy komórki szpiczaka (myeloma cell)

Hodowle tkankowe komórek ssaczych Schemat procesu glikozylacji białek

Hodowle tkankowe komórek ssaczych Przykładowe składy podłóż stosowanych do hodowli komórek ssaków

Hodowle tkankowe komórek ssaczych Zmiana liczby komórek 0,2  106  1,5  106 Początkowe stężenia: Glukoza – 5-25 mM Glutamina – 2-6 mM Końcowe stężenia: Mleczan - ~ 1,7  pocz. st. Glc Alanina i NH4+ - 2-4mM Zmiany parametrów metabolicznych podczas hodowli komórek hybrydowych

Hodowle tkankowe komórek ssaczych Sposoby prowadzenia hodowli komórek ssaków

Przykłady białek terapeutycznych produkowanych przy użyciu hodowli komórek ssaków Rodzaj białka Funkcja Typ glikozylacji ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- Tkankowy aktywator plazminogenu czynnik fibrynolityczny N-gliko Erytropoetyna lek w przypadku anemii N- i O-gliko Czynniki VII, VIII, IX i X lek w przypadku hemofilii N- i O-gliko Interleukina 2 przeciwnowotworowy immunostymulujący, anty-HIV O-gliko Interferon  przeciwnowotworowy N- i O-gliko Interferon  i  przeciwnowotworowy immunostymul., antywirusowy N-gliko G-SCF przeciwnowotworowy O-gliko Przeciwciała monoklonalne Terapia i diagnostyka N-gliko