Metody wytwarzania biofarmaceutyków Wytwarzanie białek terapeutycznych

Etapy opracowania procesu technologicznego dla wytwarzania białek terapeutycznych Konstrukcja metodami inżynierii genetycznej Izolacja genu, ewentualna modyfikacja Dobór wektora klonowania Konstrukcja wektora ekspresji Dobór układu gospodarz-wektor Biotechnologiczne opracowanie procesu technologicznego Fermentacja kolby wstrząsane fermentor laboratoryjny fermentor w skali pilotażowej optymalizacja podłoża i prowadzenia procesu produkcyjnego Obróbka zbiór komórek oczyszczanie wstępne oczyszczanie dokładne Opracowanie produktu Opracowanie postaci leku Testy farmakologiczne Testy kliniczne Dopuszczenie do obrotu

Warunki wytwarzania białek rekombinowanych Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący białko w wektorze z markerem oporności na antybiotyk i obszar induktorowy. Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk).W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora. Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C. Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L 2. Producent grzybowy – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), grzyby pleśniowe– Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. Fermentacja 4 – 8 dni. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. Białka często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji. Producent - komórki owadzie lub ssacze w hodowli tkankowej in vitro . Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotora. CHO – Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika chińskiego). BHK – Baby hamster kidney (komórki nerki chomika). Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica Standard w przypadku wytwarzania przeciwciał (komórki hybrydowe). 4. Transgeniczne rośliny lub zwierzęta

Wybór systemu ekspresyjnego Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

Produkcja białek terapeutycznych Wymagania stawiane produkcji białek terapeutycznych – UE Produkcja Produkcja polega na zwalidowanym systemie posiewowym (seed lot system), w którym używa się sprawdzonego, odpowiedniego układu gospodarz-wektor, dopuszczonego do stosowania przez odpowiednie władze. System posiewowy obejmuje kultury mateczne oraz kultury robocze, wyprowadzone z kultur matecznych. Konieczne jest wykonanie szczegółowego opisu etapów hodowli, ekstrakcji oraz oczyszczania Wykazanie zdatności układu gospodarz-wektor i walidacja systemu posiewowego muszą obejmować następujące etapy: Klonowanie i ekspresja charakterystyka fenotypowa i genotypowa komórki gospodarza, jej pochodzenia oraz składu podłoży hodowli komórkowej. dokumentacja strategii klonowania dla genu i charakterystyka rekombinowanego wektora, w tym analiza sekwencji DNA genu i flankujacych regionów kontrolnych Charakterystyka układu gospodarz – wektor mechanizm przenoszenia konstrukcji podlegającej ekspresji do komórek gospodarza liczbę kopii, stan fizyczny i stabilność konstrukcji podlegającej ekspresji wewnątrz komórki gospodarza środki indukcji i kontroli ekspresji Walidacja kultur produkcyjnych wykazanie stabilności przez pomiar przeżywalności wykazanie identyczności komórek za pomocą właściwości fenotypowych wykazanie, że kultury są wolne od kancerogennych lub zakaźnych czynników chorobotwórczych

Produkcja białek terapeutycznych Wymagania stawiane białkom terapeutycznym jako produktom finalnym – UE Konieczne wykonanie testów chemicznych, fizycznych, biologicznych i immunologicznych dotyczących identyczności, czystości, aktywności i stabilności. Dla białek ludzkich wymóg absolutny – wykazanie biozgodności – czyli identyczności produktu pod względem cech biologicznych z białkiem naturalnym. Przed uzyskaniem decyzji zwalniającej producent musi każdą serię produktu sprawdzić pod względem identyczności i czystości. W szczególności konieczne wykonanie analizy składu aminokwasowego oraz częściowej analizy sekwencji aminokwasowej i sposobu połączenia łańcuchów polipeptydowych (mostki disiarczkowe).

Wytwarzanie i izolacja białka terapeutycznego Schemat ideowy produkcji rekombinowanej stafylokinazy

Wykorzystanie S-transferazy glutationowej (GST) jako narzędzia w oczyszczaniu rekombinowanych białek. Białko docelowe jest syntezowane jako białko fuzyjne z GST. Komórki producenta poddawane są lizie i białko fuzyjne zostaje związane na kolumnie z wypełnieniem Glutathione-Sepharose. Po przemyciu złoża, białko docelowe oddziela się od złoża w wyniku działania proteazy rozszczepiającej białko fuzyjne.

Naturacja białek z ciał inkluzyjnych Problem tworzenia agregatów podczas fałdowania białek Mogą się tworzyć w bakteryjnych systemach ekspresji 1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

Mikroinjekcja DNA do zapłodnionego jaja myszy

Transgeniczne krowy jako producenci białek terapeutycznych Krowa może dostarczać rocznie 5 – 10 tys. litrów mleka. Litr mleka może zawierać około 50 g białka będącego produktem transgenu. Projekt argentyński – cztery transgeniczne krowy zawierające gen kodujący ludzką insulinę. Uważa się, że w przypadku powodzenia projektu, 25 krów transgenicznych wystarczy dla zaspokojenia potrzeb wszystkich diabetyków w Argentynie (1,5 mln osób). Pozyskiwanie preparatu zawierającego białko terapeutyczne?

Białko jaj Doskonałe źródło rekombinowanych białek Kura znosi rocznie ok. 300 jaj, a każde jajo zawiera ok. 6,5 g białka Silny promotor genu owoalbuminy, zdolny wydajnie kierować ekspresją transgenu w jajowodach transgenicznych kur, zapewnia możliwość produkcji ok. 2 g białka/jajo Obecnie drugie po mleku potencjalne źródło biofarmaceutyków z wydzielin zwierząt transgenicznych Trwają prace nad erytropoetyną, G-CFS i przeciwciałami z jaj

Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Hematopoeza Proces powstawania i różnicowania się komórek krwi (krwinek) obejmujący zachodzące w szpiku kostnym dorosłych ssaków procesy powstawania krwinek czerwonych i białych oraz wytwarzanie limfocytów w obrębie układu limfatycznego Hematopoetyczne czynniki wzrostowe Białka stymulujące końcowe etapy różnicowania komórek macierzystych Szpiku Neutropenia Stan kliniczny, w którym liczba leukocytów spada o dwa rzędy wielkości poniżej limitu Anemia Spadek poziomu eytrocytów

Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Erytropoetyna Etapy ERYTROPOEZY a) krew przenosi za mało tlenu; b) informacja o tym dociera do nerki c) rozpoczyna się produkcja hormonu erytropoetyny (EPO) d), e) pod wpływem EPO szpik kostny wytwarza czerwone krwinki

Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Erytropoetyna Ludzka EPO i rekombinowana ludzka EPO są identyczne pod względem sekwencji aminokwasów, pozycji 2 mostków disiarczkowych, 4 miejsc glikozylacji, struktury drugorzedowej. Peptyd zawiera 165 aminokwasów, masa cząsteczkowa - 30,4 kDa. Białko zbudowane jest z 4 alfa helis, które tworzą ścisłą pofałdowana strukturę białka. Rekombinowane produkty nie różnią się pod względem budowy, można jednak zauważyć ilościowe różnice w glikozylacji.

Erytropoetyna jako LEK EPO odgrywa bardzo dużą rolę w leczeniu niedokrwistości w przebiegu niewydolności nerek i u osób dializowanych. Obecnie stosuje się wyłącznie postacie rHu-EPO. Preparaty EPO alfa i beta nie różnią się działaniem leczniczym. W Polsce dostępne są preparaty o nazwie handlowej Neorecormon oraz Eprex. Tradycyjnie zalecane jest dawkowanie 3 razy w tyg. podskórnie 150–300 IU/kg. Znacznie wygodniejszym sposobem podawania leku przy podobnej skuteczności okazało się wstrzyknięcie hormonu raz w tygodniu w dawce 30 tys. IU. Pacjenci, którzy otrzymują EPO muszą mieć kontrolowany poziom żelaza, ponieważ jego zasoby w organizmie są wykorzystywane do produkcji hemoglobiny.

Erytropoetyna jako LEK Biorąc pod uwagę przede wszystkim wygodę chorych, a także usprawnienie pracy personelu medycznego, podjęto próby wynalezienia preparatów EPO, charakteryzujących się wydłużonym czasem działania, co umożliwić mogłoby podawanie leku w dłuższych odstępach czasu przy zachowanej skuteczności w zakresie wyrównywania niedokrwistości. MODYFIKACJE: EPO o zwiększonej liczbie przyłączonych cząsteczek kwasu sialowego. Modyfikacjia struktury hormonu w taki sposób, aby zmienić jego powinowactwo do receptora dla EPO. Darbepoetyna CERA

Białka terapeutyczne - przykłady Białka stymulujące powstawanie komórek krwi Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów i granulocytów (GM-CSF) G-SCF Glikoproteina, 174 aa, Układy ekspresyjne: CHO, E. coli ; nieglikozylowany także aktywny Przykładowy lek: Neupogen (Filgrastim), MW 18.8 kDa; nieglikozlylowany; wytwarzany w E. coli GM-SCF Glikoproteina, 127 aa; Układy ekspresyjne: CHO, BHK, S. cerevisiae Przykładowy lek: Leukine (Sagramostim),produkcja w S. cerevisiae; mieszanka trzech form o MW 19,5; 16,8 i 15,5 kDa. W stosunku do ludzkiej rózni się substytucją Leu23 i glikozylacją

Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Stymulacja krzepnięcia w przypadku zaburzeń krzepliwości o podłożu genetycznym Hamowanie krzepnięcia i rozpuszczanie skrzepów w przypadku np. udaru mózgu i zawału serca

Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Czynnik krzepliwości IX Glikoproteina, 415 aa, MW 55 kDa Przykład produktu: BeneFix; producent CHO Czynnik krzepliwości VIIA Glikoproteina, 406 aa, MW 50 kDa Przykład produktu: NovoSeven; producent BHK, pierwotny produkt jest wydzielany do pożywki jako pojedynczy łańcuch i następnie poprzez autokatalityczna proteolizę przekształcany w aktuwną formę dwułańcuchowa.

Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Hirudyna Specyficzny inhibitor trombiny wytwarzany przez pijawkę lekarską; 65 aa, MW 7kDa Przykład produktu: Refludan (Lepirodin). Identyczny z naturalnym białkiem, z wyjątkiem wymiany Leu na Ile na N-końcu i brakiem reszty O-sulfonowej na Tyr63. Wytwarzanie – E. coli Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) Proteaza serynowa zbudowana z 527 aa. Katalizuje reakcję przekształcenia plazminogenu w plazminę trawiącą skrzepy fibrynowe; 5 domen strukturalnych-F, P, EGF, K1, K2. Stosowana w leczeniu fibrynolitycznym ostrego zawału mięśnia sercowego Produkt: Alteplase, CHO

produkt inżynierii tPA- usunięte 3 domeny Białka terapeutyczne - przykłady Czynniki krzepliwości krwi i antykoagulanty Reteplase produkt inżynierii tPA- usunięte 3 domeny 2 naturalne domeny tPA- domena katalityczna P i domena K2 zapewniająca specyficznośc rozpoznania fibryny wytwarzana w E. coli brak domen EGF i K1- wydłużony biologiczny okres półtrwania brak domeny F1- redukuje powinowactwo do fibryny brak glikozylacji (produkcja w E. coli) TNKase wymiana reszt aminokwasów w trzech pozycjach: Thr103 na Asn (generowanie nowego miejsca glikozylacji), Asn117 na Gln (usuniecie miejsca glikozylacji), sekwencja 296-299 Lys-His-Arg-Arg wymieniona na Ala-Ala-Ala-Ala. wykazuje przedłużony okres półtrwania, zwiększenie odporności na działanie PAI-1, naturalnego inhibitora tPA- Wytwarzany przez CHO

Białka terapeutyczne - przykłady Interferony i cytokiny Glikoproteiny o wielkości 165 - 207 aa, wytwarzane przez ludzkie leukocyty, o działaniu immunomodulatorowym, antyproliferacyjnym i antywirusowym. Pięć podstawowych rodzajów: alfa, beta, gamma, omega i kappa, różniących się wielkością, sekwencja aminokwasową i specyficznością działania. Rekombinowane inteferony znajdują zastosowanie w leczeniu niektórych chorób nowotworowych, infekcji wirusowych oraz stwardnienia rozsianego Mechanizm działania: wiązanie ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek transdukcja sygnału za pośrednictwem tyrozynowoej kinazy bialkowej uruchomienie selektywnej ekspresji genów Typ interferonu Nazwa handlowa (firma) Zastosowanie IFN-2b IFN-2a IFN-1a IFN-1b IFN-1b Intron A (Schering) Roferon A (Roche) Avonex (Biogen Inc.) Betaseron (Berlex) Actimmune (InterMune Pharm. Inc.) melanoma, hepatitis C, białaczki Hepatitis C Stwardnienie rozsiane Nowotwory kości (opóżnienie postępu choroby Producenci: E. coli, CHO. Także wersje PEGylowane

Białka terapeutyczne - przykłady Hormony Szereg ludzkich hormonów ma strukturę peptydową lub białkową. Należą do nich hormony tropowe podwzgórza i przysadki mózgowej, niektóre hormony trzustki (insulina, glukagon) i wątroby (czynnik wzrostowy insulino-podobny), Glukagon Polipeptyd, 29 aa. Produkty: GlucaGen (S. cerevisiae), Glucagon (E. coli) Ludzki hormon wzrostu - somatotropina Białko, 192 aa, MW 22kDa. Produkt: Protropin (Somatrem), E. coli, zawiera dodatkową resztę Met na N-końcu. Follitropina beta Bialko dimeryczne, glikoproteina. Dwa łańcuchy; 92 aa i 111 aa Produkt: Follistim, CHO Zastosowanie w leczeniu bezpłodności kobiet spowodowanej zaburzeniami jajeczkowania Insulina

Insulina Od 1922 insulina świńska. Problem – różnica w łańcuchu B: Ala30 zamiast Thr Częściowe rozwiązanie: humanizowana insulina świńska – semisynteza Obecnie od 1982 - insulina ludzka rekombinowana

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji Gensulin (BIOTON) Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy Ekspresja w Escherichia coli Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych Etapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja Półprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymi Obróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A Oczyszczanie: chromatografia kolumnowa Dalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95% Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacja Produkt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%

Insuliny modyfikowane Lispro (Humalog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro-Lys29  28Lys-Pro29 Aspart (Novolog) Zmiana w łańcuchu B: 28Pro  28Asp Glargine (Lantus) Zmiana w łańcuchu A: 21Asn  21Gly Zmiana w łańcuchu B: dodanie 2 reszt Arg na C-końcu

Białka terapeutyczne - przykłady Enzymy - enzymy, których deficyt jest konsekwencją defektu genetycznego - enzymy jako terapeutyki (często pochodzenia innego niż ludzkie)

Białka terapeutyczne - przykłady Enzymy - Glukocerebrozydaza Glikoproteina, 497 aa, enzym lyzosomalny, hydrolizujacy glukocerebrozydy Deficyt glukocerebrozydazy – choroba Gauchera Produkt: Imiglucerase, CHO, w pozycji 495 His wymieniona na Arg, niekompletna glikozylacja – reszty mannozy jako końcowe cukry we fragmentach oligosacharydowych. Efekt: lepsze wiązanie do makrofagów Deoksyrybonukleaza I Glikoproteina, 260 aa, MW 37 kDa. Leczenie objawowe zwłóknienia torbielowatego Produkt: Pulmozyme, CHO Asparaginaza Enzym hydrolizujący asparaginę. Komórki białaczki nie mają zdolności biosyntezy asparaginy. Podanie asparaginazy chorym na białaczkę powoduje redukcję pozakomórkowej puli asparaginy a w efekcie selektywne zabicie komórek nowotworowych W leczeniu stosuje się asparaginazy produkowane przez E. coli lub Erwinia chrysantemi. Problem – immunogenność Produkt: Pegaspargase. PEGylowana L-asparaginaza z E. coli. Kowalencyjnie przyłaczony PEG 5 kDa. Znacząco zredukowana immunogenność

Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych PEGylacja - przyłączanie kowalencyjne glikoli polietylenowych do białek terapeutycznych dłuższy okres wchłaniania, zmniejszenie procesu degradacji przez proteolizę zmniejszenie antygenowości zwiększenie stabilności termicznej i mechanicznej cząsteczki dłuższa eliminacja z organizmu

Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych PEGylacja Przykłady stosowanych leków modyfikowanych: PEGylowana deaminanaza ( Adagen )- w terapii genetycznego niedoboru deaminazy adenozynowej PEGylowana L-asparaginaza (Oncospar), w terapii białaczki limfoblastycznej PEG- Intron (Pegintron- 2001) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C Pegasys (2002) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C

Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne i białkowy fragment dodatkowy zwiększenie masy cząsteczkowej leku powyżej progu nerkowego wykorzystanie specyficznych właściwości przeciwciał dla wzmocnienia ukierunkowanego działania leku wyższa aktywność formy dimerycznej w porównaniu z monomeryczną

WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA Białka fuzyjne PREPARAT WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA Amevive (dimeryczne białko fuzyjne ) umiarkowana- groźna przewlekła łuszczyca Biogen 2003(USA) Enbrel ( dimeryczne białko fuzyjne powstałe z połączenia domeny receptora TNF z rejonem Fc IgG1 ) aktywne reumatoidalne zapalenie stawów u osób dorosłych, choroba Crohna Amgen I Wyeth 1998 (USA) Wyeth Europa Ltd 2000 (EU) Ontak ( białko fuzyjne złożone z rIL-2 i zmodyfikowanej toksyny błoniczej ) skórne chłoniaki z limfocytów T Ligand Pharmaceuticalis 1999 (USA)

Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc powstałe przez połączenie zewnątrz- komórkowej domeny receptora TNF ( sTNF ) z rejonem Fc immunoglobuliny Rys. schemat immunoglobuliny 1-fragment wiążący antygen 2- region Fab 3- region Fc

Sposoby podawania leków białkowych Podawanie domięśniowe i podskórne Problem konieczności zapewnienia przedłużonego działania Polimery biokompatybilne, biodegradowalne, nieimmunogenne PLA – polimleczan PLGA – poli(D,L-mleczan-co-glikolan)

Sposoby podawania leków białkowych Implantowana pompa osmotyczna Przed implantacją system napełnia się roztworem leku. W miejscu implantacji woda przenika przez błonę do komory osmotycznej. Ilość roztworu leku wydzielanego ze zbiornika odpowiada ilości wody wchodzącej do komory Taki system zapewnia stały poziom leku białkowego w osoczu

Sposoby podawania leków białkowych Samoregulujący się system podawania insuliny

Sposoby podawania leków białkowych Podawanie doustne