Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny Centrum Doskonałości ChemBioFarm Katedra Mikrobiologii Ul. Narutowicza 11/12 80-952 Gdańsk Kierownik Katedry: prof. dr hab. Józef Kur Tel. 58 347 24 06 Fax. 58 347 18 22 kur@chem.pg.gda.pl http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Mikrobiologia/mikro.htm

Katedra Mikrobiologii - Skład osobowy Pracownicy prof. dr hab. Józef Kur – kierownik, tel. 347-23-02, kur@chem.pg.gda.pl dr inż. Paweł Sachadyn – adiunkt, tel.347-24-06, psach@altis.chem.pg.gda.pl dr inż. Radosław Pladzyk – adiunkt, tel. 347-18-22, radek@chem.pg.gda.pl dr Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka – adiunkt, tel. 347-16-05, ela25sawicka@yahoo.com dr Beata Krawczyk– adiunkt, tel. 347-23-83, beatak@chem.pg.gda.pl dr inż. Hubert Cieśliński –adiunkt, tel. 347-18-22, sufragan@wp.pl dr inż. Rafał Piątek – adiunkt, tel. 347-16-05, rafalpiatek@o2.pl dr Beata Zalewska – asystent, tel. 347-16-05, beatazalewska1@o2.pl mgr inż. Marta Wanarska – asystent, tel. 347-26-18, martkaw@wp.pl Doktoranci mgr inż. Marcin Olszewski, tel. 347-18-22, molsza.wp.pl mgr inż. Paweł Filipkowski, tel. 347-26-18, pfilip@chem.pg.gda.pl mgr inż. Katarzyna Bury, tel. 347-16-05, kasnak@wp.pl mgr inż. Lucyna Holec, tel. 347-16-05, lucyholoec@wp.pl mgr inż. Artur Gąsior, tel. 347-16-05, artgasior@wp.pl mgr inż. Marta Mróz, tel. 347-18-22, antifa5@wp.pl mgr inż. Anna Długołęcka, tel. 347-18-22, ninaad@poczta.fm mgr inż. Krzysztof Lewandowski, tel. 347-23-83, klewklew@wp.pl

Antygeny rekombinowane 1. System ekspozycji powierzchniowej sekwencji antygenowych - Escherichia coli Dr-BAM Skonstruowany szczep E. coli Dr-BAM zawiera zmodyfikowany operon dra pozwalający na ekspresję chimerycznych fimbrii Dr. Pojedyncza komórka bakteryjna na powierzchni posiada setki struktur fimbrialnych typu Dr. Każda fimbria jest homopolimerem zbudowanym z tysięcy kopii białka podjednostkowego DraE. Stworzony bakteryjny system ekspozycji sekwencji antygenowych bazuje na wykorzystaniu białka DraE jako nośnika heterogennych sekwencji antygenowych. Pozwala on na silną amplifikację na powierzchni bakterii wybranej sekwencji peptydowej poprzez jej umieszczenie w obrębie struktury białka DraE stanowiącego podjednostkę budulcową fimbrii Dr.

Antygeny rekombinowane 2. Potencjalne możliwości zastosowania systemu ekspozycji powierzchniowej Escherichia coli Dr-BAM Konstrukcja szczepów E. coli eksprymujących fimbrie Dr eksponujące wybraną sekwencję antygenową - badania z wykorzystaniem całych komórek bakteryjnych. Produkcja chimerycznych fimbrii Dr celem uzyskania wysoce immunogennego materiału białkowego do produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko eksponowanej sekwencji peptydowej. Wykorzystanie chimerycznych fimbrii Dr jako bezpieczna rekombinantowa szczepionka skierowana przeciwko patogenowi z którego wywodzi się dana sekwencja epitopowa.

Antygeny rekombinowane 3. Zalety systemu ekspozycji powierzchniowej sekwencji antygenowych Escherichia coli Dr-BAM Prosty i szybki proces konstrukcji rekombinantowego szczepu E. coli eksprymującego określoną sekwencję peptydową. Możliwość ekspozycji różnych hydrofilowych sekwencji antygenowych o wielkości od kilku do kilkunastu aminokwasów. Bardzo prosta i wydajna metoda izolacji dużych ilości chimerycznych fimbrii Dr nie wymagająca zaawansowanych technik chromatograficznych. Bardzo wysoka immunogenność struktur fimbrialnych Dr - gwarancja uzyskania wysokiej odpowiedzi immunologicznej przeciwko eksponowanej sekwencji antygenowej.

4. Zalety systemu ekspozycji powierzchniowej E. coli Dr-BAM Antygeny rekombinowane 4. Zalety systemu ekspozycji powierzchniowej E. coli Dr-BAM Fimbrie Dr są strukturami unikalnymi tylko dla specyficznego uropatogennego szczepu E. coli Dr+ - nie występują na powierzchni komercyjnie dostępnych szczepów przeznaczonych do klonowania oraz ekspresji. Poznanie na poziomie molekularnym mechanizmu tworzenia fimbrii Dr oraz znajomość struktury białka DraE - potencjalna możliwość dalszej adaptacji układu dla specyficznych zastosowań. Literatura podstawowa: 1. Zalewska B, Piatek R, Konopa G, Nowicki B, Nowicki S, Kur J. Chimeric Dr fimbriae with a herpes simplex virus type 1 epitope as a model for a recombinant vaccine. Infect Immun. 71:5505-13. 2. Piątek R, Zalewska B, Kolaj O, Ferens M, Nowicki B, Kur J. Molecular aspects of biogenesis of Escherichia coli Dr Fimbriae: characterization of DraB-DraE complexes. Infect Immun. 73:135-45.

Antygeny rekombinowane 5. Usługi świadczone w temacie powierzchniowej ekspozycji sekwencji antygenowych w układzie Dr-BAM Konstrukcja szczepu E. coli Dr-BAM kodującego białko DraE z wprowadzoną określoną sekwencją antygenową. Ustalenie optymalnych warunków produkcji chimerycznych fimbrii Dr niosących określoną sekwencję antygenową. Produkcja i oczyszczanie chimerycznych fimbrii Dr. Uzyskanie przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko sekwencji antygenowej. Kontakt: prof. dr hab. Józef Kur; kur@chem.pg.gda.pl; tel. 347 23 02 dr Beata Zalewska; beatazalewska1@o2.pl; tel.: 347 16 05 dr inż. Rafał Piątek; rafalpiatek@o2.pl; tel.: 347 16 05 mgr inż. Katarzyna Bury; kasnak@wp.pl; tel.: 347 16 05

Immunodiagnostyka toksoplazmozy – antygeny rekombinowane Toxoplasma gondii: kosmopolityczny pierwotniak polikseniczny bezwzględny pasożyt wewnątrzkomórkowy wywołujący toksoplazmozę Toksoplazmoza: choroba szeroko rozpowszechniona na całym świecie (liczba osób seropozytywnych w Polsce wynosi około 60%) wrodzona – istotny problem będący przyczyną aborcji lub wad wrodzonych u dzieci systematyczne badania prenatalne (nie wykonywane obecnie w Polsce) odgrywałyby bardzo istotną rolę we wczesnej identyfikacji zarażeń pasożytem oraz leczeniu Testy diagnostyczne: obecnie w stosowanych testach diagnostycznych wykorzystuje się głównie antygeny natywne, a rekombinantowe białka antygenowe mogą być alternatywnym źródłem antygenów Prowadzone badania: produkcja rekombinantowych białek antygenowych T. gondii w bakteryjnych systemach ekspresyjnych Escherichia coli oszacowanie przydatności otrzymanych antygenów w immunodiagnostyce Oferta wdrożeń: Prosty, szybki, czuły i tani serologiczny test diagnostyczny różnicujący toksoplazmozę ostrą i przewleką Kontakt: prof. dr hab. Józef Kur; kur@chem.pg.gda.pl; tel. 347 23 02 mgr inż. Lucyna Holec; mgr inż. Artur Gąsior

Białka SSB-podobne Deinococcaceae i Thermaceae – jako uniwersalne narzędzia w biologii molekularnej Wiążą się z jednoniciowym DNA Potencjalne zastosowanie w nauce i przemyśle: Jako „wzmacniacz” reakcji PCR, multipleks PCR Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) Techniki analityczne, separacja DNA Rekcje sekwencjonowania trudnych matryc Inne techniki z zastosowaniem jednoniciowego DNA i RNA Prowadzone badania: Produkcja białek w bakteryjnym systemie ekspresyjnym Escherichia coli Oczyszczanie, badanie właściwości Otrzymywanie na skale komercyjną Oferta szkoleń: Precyzyjnie regulowane i kontrolowane w czasie rzeczywistym hodowle mikroorganizmów w bioreaktorze 5l. Oferta wdrożeń: Komercyjne preparaty w/w białek SSB Kontakt: prof. dr hab. Józef Kur; kur@chem.pg.gda.pl; tel. 347 23 02 mgr inż. Olszewski Marcin (molsza@wp.pl) - termostabilne białka SSB Thermus aquaticus i T. thermophilus mgr inż Filipkowski Paweł (pfilip@chem.pg.gda.pl) – termostabilne i mezofilne białka z Deinococcus radiodurans, D. geothermalis, D. radiopugnans

Zastosowanie białek TaqSSB i TthSSB Inne techniki wykorzystujące ssDNA i RNA Reakcje PCR Reakcje sekwencjonowania trudnych matryc Reakcje multipleks PCR Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) Legenda: Zastosowanie dowiedzione Techniki analityczne - separacja DNA Zastosowanie potencjalne Przykład użycia białka TaqSSB w reakcji PCR - amplifikacji poddano fragment genu CMV Wynik reakcji PCR w 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Reakcji PCR podanno fragment genu CMV, który amplifikowano w obecności białka TaqSSB, jak i bez niego. U góry zaznaczono ilość cząsteczek DNA (pCDNA21/CMV) dla każdej amplifikowanej próbki.

Termostabilne białko MutS jako narzędzie do wykrywania mutacji punktowych MutS-SYBR-GOLD MutS chroni niekomplementarne DNA przed nukleazami Retardacja DNA przez MutS MutS opóźnia migrację niekomplementarnego DNA Fuzyjne białka MutS MutS - rozpoznaje niekomplemetarność w DNA. Domena reporterowa - dostarcza silny sygnał. Immobilizowana sonda mikropłytka domena reporterowa MutS DNA badane Bezbarwny substrat Barwny produkt hydrolizy niekomplementarnego DNA opóźniane przez MutS fluorescencja = ochrona = mutacja Oznaczenie w jednej probówce, 360 ng DNA 200-700 bp 1-3 g histag-MutS 1-3 g histag-MutS, 50-200 ng produktu PCR Oferta ekspertyz: Komputerowa analiza sekwencji nukleotydowych, projektowanie układów do diagnostyki PCR Oferta wdrożeń: Rekombinantowe szczepy do produkcji białka histag- MutS oraz fuzji MutS z GFP i -galaktozydazą Kontakt: dr inż. Paweł Sachadyn (psach@altis.chem.pg.gda.pl) dr inż. Anna Stanisławska-Sachadyn (annast@altis.chem.pg.gda.pl) Potencjalna możliwość detekcja mutacji w genomowym DNA bez amplifikacji PCR

Diagnostyka molekularna w medycynie i przemyśle spożywczym Metody genotypowe identyfikacji i różnicowania bakterii w badaniach mikrobiologicznych w oparciu o techniki PCR Od ponad 10 lat w rutynowej diagnostyce chorób infekcyjnych wzrasta zastosowanie testów opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych, takich jak PCR. Pozwala to na szybką diagnozę o wysokim stopniu czułości i specyficzności. Potencjalne zastosowanie: wykrywanie i identyfikacja czynników infekcyjnych rozwiązywanie problemów epidemiologicznych w oparciu o technikę ADSRRS-fingerprinting Prowadzone badania: konstrukcja kitu diagnostycznego opartego o technikę ADSRRS-fingerprinting opracowywanie testów diagnostycznych do identyfikacji patogenów roznoszonych przez kleszcze dla przesiewowych badań epidemiologicznych środowiska, oceniających stan zagrożenia tymi patogenami dla ludzi różnicowanie gatunków Borrelia burgdorferii sensu lato (B. burgdorferii sensu stricto, B.afzelii, B.garini) oraz B.valaisiana i B.lusitaniae techniką recA-PCR/RFLP (nowa metoda szybkiej identyfikacji gatunków należących do rodzaju Borrelia) Oferta szkoleń: W zakresie technik biologii molekularnej w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych Oferta wdrożeń: Kity diagnostyczne w zakresie przedstawionych badań Kontakt: prof. dr hab. Józef Kur; kur@chem.pg.gda.pl; tel. 347 23 02 dr Beata Krawczyk (beatak@chem.pg.gda.pl) - ADSRRS, recA-PCR/RFLP mgr inż. Krzysztof Lewandowski (klewklew@wp.pl ) - ADSRRS

Termostabilna β-D-galaktozydaza Pyrococcus woesei oraz zimnolubna β-D-galaktozydaza Pseudoalteromonas sp. 22b-produkcja i zastosowanie Enzymy te: katalizują reakcję hydrolizy wiązań β-1,4-glikozydowych katalizują reakcję transglikozylacji najbardziej znanym substratem tych enzymów jest cukier mleczny – laktoza Potencjalne zastosowanie w przemyśle: produkcja bezlaktozowego mleka i jego przetworów dla ludzi nie tolerujących laktozy synteza oligosacharydów stosowanych jako probiotyczne dodatki do żywności produkcja syropu glukozowo-galaktozowego dla na potrzeby przemysłu spożywczego produkcja bezlaktozowej serwatki, składnika nowoczesnych pasz zwierzęcych Prowadzone badania: produkcja enzymu w bakteryjnym systemie ekspresyjnym Escherichia coli produkcja enzymu w drożdżowym systemie ekspresyjnym Pichia pastoris oczyszczanie, badanie właściwości i immobilizacja enzymu Oferta szkoleń: Klonowanie i ekspresja genów w bakteryjnym i drożdżowym systemie ekspresji. Oferta wdrożeń: Rekombinantowy szczep Pichia pastoris do produkcji β-D-galaktozydazy P. woesei. Kontakt: prof. dr hab. Józef Kur; kur@chem.pg.gda.pl; tel. 347 23 02 mgr inż. Marta Wanarska (martka.chem@wp.pl) - Termostabilna β-D-galaktozydaza Pyrococcus woesei dr inż. Hubert Cieśłiński (sufragan@wp.pl) - zimnolubna β-D-galaktozydaza Pseudoalteromonas sp. 22b

ZAPRASZAMY PAŃSTWA DO WSPÓŁPRACY PONADTO OFERUJEMY Szkolenia w zakresie nowoczesnych technik biologii molekularnej Projektowanie i wykonywanie mikrobiologicznych testów diagnostycznych w oparciu o technikę PCR Projektowanie i wykonywanie układów ekspresyjnych E. coli i Pichia pastoris do produkcji wybranych białek. ZAPRASZAMY PAŃSTWA DO WSPÓŁPRACY