Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej

Wyodrębnianie pozytywnych klonów Immunizacja Komórki śledziony Komórki szpiczaka Fuzja Komórki hybrydomy Test na przeciwciała Wyodrębnianie pozytywnych klonów Subklonowanie Produkcja przeciwciał in vivo Produkcja przeciwciał in vitro Zamrażanie komórek hybrydomy Przeciwciała monoklonalne

Produkcja przeciwciał monoklonalnych metodą PHAGE DISPLAY

ADAM17

Stworzenie i wyselekcjonowanie aptameruRNA (lub DNA) Cel projektu: Stworzenie specyficznego inhibitotra hamującego aktywność proteolityczną sekretazy ADAM17 Stworzenie i wyselekcjonowanie aptameruRNA (lub DNA) stworzenie i wyselekcjonowanie fragmentu przeciwciała scFV (ang. single chain variable fragment) metodą ekspresji fagowej

Co to takiego rekombinowane przeciwciało w formacie scFV? Fab Fv Fc Linker Budowa przeciwciała rekombinowanego scFV Budowa przeciwciała

Fagemidowa biblioteka ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych Tomlinson I+J wektor fagemidowy pIT2 M13 ori colE1 ori amp lac promoter scFV myc pIII

Tomlinson I+J : rozmiar biblioteki I 1.47x108 J 1.37x10 8

Budowa faga filamentarnego

Bakterie - biblioteka fagemidów Jak to działa? fagemid H L + Fag pomocniczy KM13 ssDNA Bakterie - biblioteka fagemidów Infekcja Ampicylina fagemid H L białko pIII Kanamycyna Fagi potomne wykorzystywane do selekcji białko pIII-scFV

Immunoselekcja - wyszukiwanie fagów wiążących antygen Fagi specyficznie wiążące antygen Fagi negatywne Fagi negatywne Fagi specyficznie wiążące antygen

Mianowanie i amplifikacja pozytywnych fagów Fagi specyficznie wiążące antygen Elucja przy pomocy trypsyny Fagi poliklonalne Mianowanie i amplifikacja pozytywnych fagów

Proteoliza białka pIII przez trypsynę fagemid H L Trypsyna Fagi puste są nieinfekcyjne Fagi z scFv po działaniu trypsyny mogą infekować bakterie fagemid H L

Jak mianuje się pozytywne fagi? Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Podłoże z ampicyliną Liczymy kolonie bakterii

Jak amlifikuje się pozytywne fagi? Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Pożywka z ampicyliną Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen phage(mid) H L

I znów fag pomocniczy............ + Infekcja phage(mid) H L + Fag pomocniczy KM13 Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen Infekcja phage(mid) H L Fagi potomne wiążące antygen Kolejna runda immunoselekcji na antygenie

Miano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml] Biblioteka I: Biblioteka J Runda I 9.5 x 105 3.3 x105 RundaII 1.7 x 107 5.5 x 107 RundaIII 1.2 x 1010 1.6 x 1010

Testowanie wyodrębnionych fagów poliklonalnych Miano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml] Przeciwciała rozpoznające faga KM13 Biblioteka I: Biblioteka J Runda I 9.5 x 105 3.3 x105 RundaII 1.7 x 107 5.5 x 107 RundaIII 1.2 x 1010 1.6 x 1010 HRP HRP Fagi specyficznie wiążące antygen

Poliklonalnay fagowy test ELISA anty-metADAM17 Biblioteka I Biblioteka J Runda I II III I II III

Jak z populacji poliklonalnych fagów wiążących metADAM17 wyodrębnić fagi monoklonalne? Hodowla poszczególnych kolonii na płytce 96-studniowej Szalki z bakteriami po mianowaniu 2 Infekcja bakterii Fagiem KM13 3 Monoklonalne fagi potomne analizowane testem ELISA

Monoklonalny fagowy test ELISA anty ADAM17 II III

Ale jak otrzymać rozpuszczalne scFV?

Infekcja bakterii HB2515 monoklonalnymi fagami anty metADAM17 pozwala na produkcję rozpuszczalnych scFV

Immunoselekcja na komórkach Biotynylacja ADAM17 + ADAM17 - Streptawidyna z kuleczkami magnetycznymi m m Fagi m m m m Elucja fagów które związały się tylko do komórek ADAM+ Rozdzielenie komórek na seperatorze magnetycznym

Oczyszczanie scFV Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem białek bakteryjnych A oraz L. Chromatografia powinowactwa na złożach z jonami niklu lub wolframu. Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał wiażących metkę c-myc.