Chromatografia dr inż. Andrzej Radomski CHROMA (gr. barwa)  CHROMATOGRAFIA 1906 – M. Cwiet (rosyjski botanik – Warszawa) Rozdzielenie mieszaniny barwników w ekstrakcie roślinnym na kolumnie z węglanem wapnia (kredą) – chromatografia kolumnowa (cieczowa) – LC Martin i Synge (1941) – chromatografia bibułowa – Nobel! – PC James i Martin (1952) – chromatografia gazowa – GC Stahl (1956) – chromatografia cienkowarstwowa – TLC koniec lat 60-ych – wysokosprawna chromatografia cieczowa – HPLC początek lat 80-ych – chromatografia wykluczania przestrzennego – SEC

Przegląd technik chromatograficznych cieczowa – LC (liquid chromatography) bibułowa – PC (paper chromatography) odwrócony układ faz cienkowarstwowa – TLC (thin layer chromatography) normalny układ faz (adsorpcyjna) odwrócony układ faz (podziałowa) wysokociśnieniowa – HP-TLC (high perssure...) gazowa – GC (gas chromatography) adsorpcyjna (gaz-ciało stałe) podziałowa (gaz-ciecz, GLC) wysokosprawna cieczowa – HPLC (high performance liquid chromatography) normalny układ faz (adsorpcyjna i podziałowa) jonowymienna wykluczania przestrzennego, żelowa – SEC, GPC (size exclusion chromatography, gel permeation chromatography) fluidalna – SFC

Mechanizm rozdziału chromatograficznego Współczynnik podziału Model układu chromatograficznego złożony jest z szeregu półek, na których osiągany jest stan równowagi. Transport substancji wzdłuż układu odbywa się w fazie ruchomej. Przykład dla K =1.

Mechanizm rozdziału chromatograficznego

Rozdzielczość układu chromatograficznego tr czas retencji (maksimum piku), tm czas „martwy” układu, tr' skorygowany czas retencji, Dtp szerokość podstawy piku, Dt1/2 szerokość piku w połowie wysokości wysokość równoważna półce teoretycznej:

Rozdzielczość układu chromatograficznego współczynnik retencji retencja względna rozdzielczość pików DtAB - odległość między maksimami pików substancji A i B. Piki są tym lepiej rozdzielone im wartość R jest większa, a rozdzielone do linii podstawowej, gdy R = 1.5. Jeżeli R = 1, to piki o podobnej wysokości są rozdzielone w ok. 96 %.

Zależność sprawności kolumny od prędkości przepływu fazy ruchomej niejednorodne procesy przepływu (dyfuzja wirowa) dyfuzja osiowa (większe znaczenie w chromatografii gazowej) brak równowagi w wyniku oporów przenoszenia masy (powolna dyfuzja w ziarnach, może być też adsorpcja – desorpcja na powierzchni)

Analiza ilościowa – metody Normalizacji wewnętrznej - porównanie pól pików, suma = 100% - dobre wyniki tylko w nielicznych przypadkach, np. analiza frakcji benzyny, nafty Normalizacji korygowanej - jw., ale pola mnożone przez współczynniki zależne od reakcji detektora - poprawne wyniki tylko w przypadku obecności wszystkich substancji na chromatogramie; może być wykorzystana do analiz porównawczych

Analiza ilościowa – metody Kalibracji bezwzględnej (wzorca zewnętrznego) - na podstawie roztworów wzorcowych wykonywana jest krzywa kalibracyjna zależności pola piku od ilości oznaczanej substancji - szybka i poprawna pod warunkiem stosowania aparatu dobrej jakości oraz powtarzalnego dozowania

Analiza ilościowa – metody Wzorca wewnętrznego - krzywa kalibracyjna opisuje zależność między ilością oznaczanej substancji a stosunkiem pól pików substancji i wprowadzonego do próbki wzorca - dłuższa niż poprzednia, ale daje poprawne wyniki niezależnie od wielkości zadozowanej próbki

Schemat chromatografii gazowej N2, He, Ar, H2

Komora dozowania - inżektor

Fazy stacjonarne w chromatografii gazowej 100% methylsilicon poly(dimethylsiloxane) N-2-methylpropionyl- -L-valin-t-butylamid cyanopropyl trifluoropropyl phenyl vinyl polyethylenglycol polyethylenglycol-2-nitroterephtalate

Detektory w chromatografii gazowej TCD termokonduktometryczny – pomiar zmiany przewodności drutu umieszczonego w strumieniu gazu nośnego – uniwersalny, ale mała czułość FID płomieniowo-jonizacyjny – pomiar prądu jonizacji – wykrywa związki spalające się w płomieniu (nie wykrywa np. wody), mała czułość ECD wychwytu elektronów – zawiera źródło radioaktywne – selektywny wobec związków zawierających ugrupowania łatwo polaryzowalne, jak chlorowce lub grupy nitrowe, wysoka czułość, mały zakres liniowości NPD, FTD azotowo-fosforowy, płomieniowo-termojonowy – zawiera sól alkaliczną (Rb lub Cs), której obecność ułatwia jonizację związków azotu i fosforu, duża czułość na związki zawierające N lub P FPD płomieniowo-fotometryczny – rejestruje światło o charakterystycznej długości fali, emitowane przez związki siarki i fosforu TEA pirolityczno-chemiluminescencyjny – selektywny detektor NO MS spektrometr mas

Chromatograf cieczowy (HPLC, SEC)

Detektory w chromatografii HPLC UV-VIS spektrofotometr UV-VIS, dość uniwersalny, dobra czułość, szeroki zakres liniowości, możliwość pracy przy różnej długości fali DAD jw. z matrycą diodową, jednoczesny pomiar w całym spektrum RID refraktometr różnicowy, najbardziej uniwersalny, mała czułość, wrażliwy na zmiany parametrów eluentu PMDE elektrochemiczny, duża selektywność i czułość TEA chemiluminescencyjny, selektywny na nitrozwiązki CI-MS spektrometr mas z jonizacją chemiczną TSP-MS spektrometr mas z odparowaniem rozpuszczalnika DVD wiskozymetr różnicowy – pomiar lepkości stosowany w SEC LALLS detektor rozpraszania światła – do pomiaru masy cząsteczkowej w SEC

Fazy stacjonarne w HPLC polarna (normal phase – NP) niepolarna (reverse phase – RP) podstawowy eluent: n-heksan, cykloheksan modyfikatory: 2-propanol, chloroform, dichlorometan, THF podstawowy eluent: woda modyfikatory: metanol, acetonitryl, THF, bufory, sole

Cechy dobrego eluentu:  nie powinien działać szkodliwie na rozdzielane związki i wypełnienie kolumn;  powinien dobrze rozpuszczać analizowaną mieszaninę i umożliwiać detekcję jej składników;  powinien charakteryzować się dużą czystością;  mała lepkość w temperaturze pomiaru  przy detekcji spektrofotometrycznej przezroczystość w badanym zakresie UV  wysoka higroskopijność eluentu może powodować zmianę jego właściwości  przed analizą powinien być odgazowany ponieważ pęcherzyki gazu mogą przeszkadzać przy detekcji i spowodować spadek sprawności kolumny  rozpuszczalniki niskowrzące mają tendencję do tworzenia pęcherzyków w kolumnie i detektorze

Odgazowanie  ogrzewanie eluentu do temperatury zbliżonej do jego temperatury wrzenia - zmniejszenie rozpuszczalności gazów  ultradźwięki - fala podłużna rozprzestrzeniając się w ośrodku powoduje jego drgania i lokalne zmiany ciśnienia - obniżenie ciśnienia powoduje wydzielenie gazów, ponowne ich rozpuszczenie przy wzroście ciśnienia jest znacznie wolniejsze, co pozwala im opuścić roztwór  przedmuchiwanie gazem obojętnym - najlepsze wyniki daje He

Dobór warunków detekcji UV Kryteria: rozpuszczalność próbki wybór długości fali przezroczystość rozpuszczalnika szybkość analizy szumy

Dobór warunków detekcji UV dla izomerów punkt izozbestyczny

Warunki detekcji dla mieszaniny związków warunki minimalne: 216/230/280nm, optymalne: 216/230/250/280nm – konieczna zmiana l w trakcie analizy!

Badanie układów celuloza-przeciwutleniacz przeciwutleniacze fenolowe Dzięki obecności pierścieni aromatycznych związki wykazują silną absorpcję UV. detektor refraktometryczny (współczynnik załamania światła) uniwersalny, ale mało czuły, wrażliwy na zmiany temperatury i rozpuszczalnika detektor spektrofotometryczny UV specyficzny, mało wrażliwy na zmiany temperatury i przepływu, duży zakres liniowości

Optymalizacja warunków analizy HPLC przeciwutleniaczy UV 230 nm UV 280 nm RI kolumna Phenomenex Luna 3m C18 o długości 15 cm, temperatura 55°C, detektor 1 UV 230/280 nm, detektor 2 RI eluent 5%CH3COOH(A):metanol(B) w stosunku: analizowany związek THBP BHA OG HBHT BHT LG stosunek A:B 40:60 35:65 35:65 30:70 10:90 10:90

Krzywe kalibracyjne dla badanych przeciwutleniaczy BHT 280 nm

Optymalizacja warunków analizy azotanów

Wyniki analizy chromatograficznej

Kalibracja spektrofotometr UV 0,2÷200 mg/dm3 konduktometr 2÷200 mg/dm3

Metody ekstrakcji kory A: Próbka o masie 5g umieszczona została w aparacie Soxhleta i ekstrahowana wodą przez 2h. B: Próbka o masie 1g poddana była gotowaniu w wodzie przez 30 min.; C: Próbka o masie 1g została próżniowo nasycona wodą, przy czym cykl obniżania ciśnienia i nasycania powtórzony był 3- krotnie. D: Próbka o masie 1g została próżniowo nasycona wodą i umieszczona w zamrażalniku na 3h, rozmrożona i poddana jeszcze dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania. E: Próbka o masie 1g została umieszczona w płuczce ultradźwiękowej na 30 min.

średnia masa cząsteczkowa polimeru: Opis polimerów (niejednorodność masy cząsteczkowej, stopnia polimeryzacji) średnia masa cząsteczkowa polimeru: liczbowa wagowa polidyspersja lepkościowa z-średnia

Chromatografia wykluczania przestrzennego (żelowa, SEC, GPC) Fazy stacjonarne Najczęściej stosowana: PS/DVB: polistyren sieciowany diwinylobenzenem Inne: szkło, krzemionka, sieciowane polimery akrylowe, dekstrany

Mechanizm rozdziału w SEC

Mechanizm SEC Dla cząsteczek o większych rozmiarach dostępna jest mniejsza objętość porów, skutkiem czego jest mniejsza objętość retencji. Zakres wielkości rozdzielanych cząsteczek zależy od rozmiarów porów fazy stacjonarnej. Rozdzielczość wypełnienia ograniczona jest z góry granicą wykluczania, a z dołu granicą rozdzielania żelu.

Kalibracja w SEC Z.Grubisic, P.Rempp, H.Benoit, J. Polym. Sci. B, Polym. Lett., 5 (1967), 753

Kalibracja w SEC Kalibracja bezwzględna Seria wzorców wąskodyspersyjnych (najczęściej polistyren) Ograniczona dostępnością wzorców Kalibracja szerokim wzorcem (korygowana) Wymaga próbki oznaczanego polimeru o znanych co najmniej dwóch parametrach: Mn , Mw , [h] lub dwóch próbek Kalibracja oligomerów i związków małocząsteczkowych Rozdział na poszczególne pasma, którym można przypisać właściwą M. Jako parametr uniwersalny proponowana jest objętość molowa.

Kalibracja w SEC Kalibracja uniwersalna Wymaga detektora wiskozymetrycznego Pomiar h oraz znane c dają [h] – bezwzględne oznaczenie M Kalibracja “uniwersalna” (pseudouniwersalna) Wymaga znajomości współczynników K i a w warunkach oznaczenia (rozpuszczalnik, temperatura)

kalibracja Graniczna liczba lepkościowa Równanie Marka-Houwinka-Kuhna Iloczyn [h]M jako uniwersalny parametr kalibracyjny Objętość hydrodynamiczna kłębka polimeru w warunkach rozdziału (r. Einsteina) (teoria Flory’ego-Foxa)

Efektywność rozdziału kolumny Vt objętość pustej kolumny V0 objętość między ziarnami sorbentu (żelu) Vi objętość porów sorbentu Vm całkowita objętość rozpuszczalnika w kolumnie Vm = V0 + Vi e0 porowatość wypełnienia kolumny V0 = Vt e0 ei porowatość sorbentu (żelu) Vi = Vt (1 - e0) ei Kd współczynnik podziału 0 < Kd < 1 VR objętość retencji VR = V0 + Kd Vi

Kryteria doboru rozpuszczalnika do SEC rozpuszczalność próbki – czasem dopiero w wysokiej temperaturze obojętność chemiczna wobec wypełnienia mała lepkość w temperaturze pomiaru w odróżnieniu od “klasycznej” HPLC nie ma zasadniczego znaczenia zdolność rozdzielcza (“moc”) eluentu w przypadku detekcji spektrofotometrycznej przezroczystość w badanym zakresie UV wzrost lepkości rozpuszczalnika powoduje wzrost H ok. ~ N1/2 rozpuszczalniki niskowrzące mają tendencję do tworzenia pęcherzyków w kolumnie i detektorze wysoka higroskopijność eluentu może powodować zmianę jego właściwości

Właściwości rozpuszczalników

Detektory w chromatografii polimerów RID refraktometr różnicowy, najbardziej uniwersalny, mała czułość, UV-VIS spektrofotometr, dość uniwersalny, dobra czułość, szeroki zakres liniowości, możliwość pracy przy różnej długości fali DVD wiskozymetr różnicowy pomiar lepkości (granicznej liczby lepkościowej) RALLS detektory rozpraszania światła LALLS sygnał zależy od masy cząsteczkowej MALLS możliwość bezwzględnego pomiaru

spektrofotometr UV mierzy właściwość badanego związku (nie roztworu) mało wrażliwy na zmiany temperatury i przepływu wykazuje dużą czułość wobec związków absorbujących w UV duży zakres liniowości (104) umożliwia jednoczesne oznaczanie składnika głównego i śladów może wystąpić wrażliwość na zmiany przepływu, a także mogą pojawić się piki substancji nie absorbujących w UV, co związane jest ze zmianą współczynnika załamania światła (zmiana natężenia odbić od powierzchni bocznych) nie stosuje się zazwyczaj celki odniesienia ze względu na wprowadzany dodatkowy szum

refraktometr różnicowy mierzy różnicę właściwości roztworu badanego i odniesienia duża wrażliwość na zmianę składu i przepływu eluentu bardzo wrażliwy na zmiany temperatury (termostatowanie ±0,001°C) detektor uniwersalny, lecz mniej czuły od UV (2 rzędy) dla M > 10 kD można przyjąć niezależność reakcji detektora od M

Celuloza i pochodne celuloza R = H triazotan celulozy R = NO2 tri(fenylokarbaminian) celulozy R =

Analiza SEC celulozy w papierze papier siarczynowy papier na bazie celulozy z bawełny 1903r. Franciska Sundholm, Maria Tahvanainen, Journal of Chromatography A, 1008 (2003) 129–134

Analiza celulozy z detekcją RI/LS B.Wittgren. B.Porsch, Carbohydrate Polymers, 49 (2002), 457

Degradacja termiczna celulozy A.M. Emsley, M. Ali, R.J. Heywood, Polymer, 41 (2000) 8513–8521

Analiza oligomerów S.V.Greene, V.J.Gatto, Journal of Chromatography A, 841 (1999), 45

Chromatografia oligomerów 1° chromatografia wykluczania przestrzennego (SEC) brak oddziaływań z fazą stacjonarną decyduje konfiguracja przestrzenna 2° chromatografia adsorpcyjna (LAC) decydują oddziaływania z fazą stacjonarną 3° chromatografia w warunkach krytycznych (LCCC) kompensacja efektów sterycznych i oddziaływań z fazą stacjonarną Dobór eluentu umożliwia realizację wszystkich trybów chromatografii na tej samej kolumnie

Zależności kalibracyjne w chromotografii oligomerów W trybie SEC objętość retencji maleje ze wzrostem M, w trybie LAC rośnie, w trybie LCCC nie zależy od M! W LCCC objętość retencji może zmieniać się z funkcyjnością badanego oligomeru.

Odwrotna SEC dla żeli P.DePhillips, A.M.Lenhoff, Journal of Chromatography A, 883 (2000), 39

Odwrotna SEC dla celulozy włóknistej włókno objętość porów powierzchnia właściwa średni rozmiar porów (ml/g) (m2/g) (nm) CLY1 0.59/0.47 430/310 28/30 CLY2 0.71/0.62 462/404 31/31 CLY3 0.70/0.57 490/400 29/28 mCMD 0.49/0.49 332/368 29/26 A. Kongdee, T. Bechtold, E. Burtscher, M. Scheinecker, Carbohydrate Polymers, 57 (2004) 39–44

Dobór warunków analizy estrów kalafonii bremasin 1260 UV 265 nm RI Estry kalafonii i gliceryny lub trietylenoglikolu. kolumna: Nucleogel 500-10, eluent: chloroform, detektor UV 265nm

Badanie składu mieszanin estrów kalafonii zawartość wolnej kalafonii: bremasin 1380 ~1% bremasin 1260 ~12% zastosowano numeryczną dekonwolucję (rozplot) pików błąd oznaczania składu: 0,2÷2,3% (bzwgl.)  publikacja (Annals of Warsaw Agricultural Unversity, Forestry and Wood Technology)