3/26/2017 Zróżnicowanie DNA a zmienność cech ilościowych u odmian pszenicy zwyczajnej Mirosław Tyrka Pracownia Genetyki Populacji Akademia Polonijna w Częstochowie

Dzisiejsze wyzwania dla hodowli roślin 3/26/2017 Dzisiejsze wyzwania dla hodowli roślin wzrost produktywności odmian rozszerzenie areału upraw wytworzenie odmian mieszańcowych manipulacja genami odporności na patogeny i szkodniki poprawa jakości żywności Total productivity-- total yields for agronomic crops have increased from 35 to over 200% in certain crops. This has been accomplished primarily through improvements in crop performance and selection for larger and more numerous inflorescences, bigger seed heads, more seeds per head, and the correct matching and breeding of cultivars for specific production practices, namely the use of fertilizers. This is where Dr. Norman Borlgue made his most significant contributions. I'll get back to his story a little later. Expansion of production area-- Plant breeders have been able to expand the range of environments and soils that a particular crop can grow. For example, the introduction of Scottish red spring wheat germplasm into the breeding program in Otonabee, Ontario, allowed for the development of the cultivar 'Red Fife', a spring wheat cultivar suitable for the prairies. But plant breeding is never static. Continuing on this success, new cultivars have now been produced that have shorter maturation times or that are more winter hardy. This has again increased the area on which these crops can be grown. Drought tolerance is another area where plant breeders have been able to apply their art. Breeding for drought tolerance has allowed for the production of sorghum in the southwestern Great Plains which has now become a significant economic input to the local economy.

Po co nam markery molekularne? Wykorzystanie praktyczne: Wspomaganie procesu selekcji w hodowli, czyli MAS Identyfikacja odmian – prawa autorskie, obrót materiałem siewnym Wykorzystanie w badaniach: mapowanie genetyczne cech jakościowych i ilościowych klonowanie genów

MAS Selekcja wspomagana markerami Marker Assisted Selection Selekcja w oparciu o markery DNA zwykle niezależna od: stadium wzrostu rośliny i czynników środowiskowych zalety: wczesna selekcja, szybkie nagromadzanie pożądanej cechy, nie niszczy testowanego materiału skrócenie czasu wytworzenia nowej odmiany Selekcja genu(ów) W celu oznaczenia obecności wprowadzonego genu stosowana kiedy bezpośredni test fenotypowy nie jest możliwy, zbyt kosztowny lub stosowany w późnym stadium rozwojowym Selekcja tła W celu przyspieszenia powrotu do rodzica wypierającego Doświadczalnie stwierdzono wysoką skuteczność markerów molekularnych do selekcji tła w programach wypierających

Cel badań Ocena zmienności w grupie odmian pszenicy ozimej uwzględniającej odmiany lokalne przystosowane do polskich warunków klimatycznych wg: pochodzenia (COP) fenotypu DNA (PstI-AFLP, Alw44I-AFLP, SSR, STS) Ustalenie wzajemnych zależności pomiędzy ww. miarami podobieństwa Wyselekcjonowanie oznaczeń DNA, do zastosowania w ocenie zmienności genetycznej materiału pod kątem wykorzystania w hodowli

Materiał badawczy 82 odmiany pszenicy zwyczajnej: Alba, Al'bidum-11, Al'bidum-114, Alcedo, Almari, Antonińska Wczesna, Arda , Aria, Asta, Aurora, Balta, Begra, Beta, Biała Kaszubska, Biały Krzyż, Bogatka, Bożena, Choryńska, Dana, Dańkowska Graniatka, Dnestrowskaja 25, Emika, Gama, Grana, Halina, Holme, Iduna, Jana, Jasnocha Włoszanowska, Jawa, Kaja, Kamila, Kaukaz, Komorowska, Konstancja Granum, Konstancja Wierzbieńska, Korweta, Krupnokolosaja, Lama, Lanca, Leszczyńska Wczesna, Litwinka, Liwilla, Luna, Lutescens 17, Lutescens 31, Lutescens 38/72, Malwa, Maris-Huntsman, Mironowskaja 808, Mironowskaja 25, Mobela, Modra, Muras, Niewylegajaca, Nike, Niwa, Oda, Olza, Panda, Parada, Płocka, Polanka, Puławska Wczesna, Rada, Rosa, Rota, Rysa, Saga, Salwa, Severokubanskaja-43, Sobieszyńska-44, Solid, Stepnaya-40, Stieglera-22, Strzelecka, Svaloefs-0987, Wanda, Weneda, Wysokolitewka-Oltarzewska, Wysokolitewka-Sztywnosloma, Zeta

Analiza COP: metody Nazwa Pochodzenie Kraj Rok 1) Alcedo Record/Poros//Carsten-ROEM.3 DEU 1978 2) Almari Maris-Huntsman/Alcedo POL 1989 3) Antonińska Wczesna Inversable/Wysokolitewka Sztyw POL 1959 4) Arda Maris Huntsman/C-474/73 POL 1990 … … ... ... 78) Wanda N-320/Maris Huntsman//Lanca POL 1997 79) Weneda Kaukaz/Tetrix//C-1073-67 POL 1984 80) Wysokolitewka-Oltarz sel. Wysokolitewka POL 1961 81) Wysokolitewka-Sztyw Wielki Książe Saski/Ostka Mikulicka POL 1961 82) Zeta Mironowskaja 808//Herold/Grana POL 1979 VURV http://genbank.vurv.cz/wheat/pedigree/

Analiza COP: wyniki (1) Rys 1. Zestawienie odmian o największym wpływie [%] na rodowody analizowanych genotypów pszenicy

Analiza COP: wyniki (2) 3/26/2017 I II III IV V VI VII I Maris Huntsman; II – Akakomugi, Dankowska 40; III – Bezostaja; IV – Mironowskaja 808; VI – Wysokolitewka Sztywnosłoma

Cechy ilościowe: metodyka Badane cechy: 1)      przezimowanie (PRZ). 2)      daty pełni kłoszenia (KLO) 3)      daty pełni kwitnienia (KWI). 4)      wysokość roślin w cm (WR), 5)      długość kłosa w cm (DLK), 6)      liczbę kłosków w kłosie (LKK), 7)      liczbę ziarniaków w kłosie (LZK) 8)      masę ziarniaków z kłosa w g (MZK). 9)  płodność kłoska, (PLK), 10)  masę 1000 ziarniaków (MTZ), 11)  zbitość kłosa, (ZK) 12)  zawartości białka ogólnego (BIA) analiza wariancji, analiza skupień na bazie odległości Euklidesa

Cechy ilościowe: wyniki 3/26/2017 Cechy ilościowe: wyniki wczesne, niskie 1 2 3 4 a b późne, MZK późne, zbity kłos I–wys płodność kłoska; II-wysokie, dl. kłosy, III-późne, IV-wczesne, niskie wysokie, -LZK, -PLK -PRZE, PLK

METODYKA: ANALIZY DNA Izolacja DNA metodą Milligan’a (1992) PstIAFLP i Alw44IAFLP Trawienie enzymem PstI lub Alw44I i odpowiednio ligacja adaptorów Amplifikacja nieselektywna Amplifikacja selektywna 30 starterów selekcyjnych PstIAFLP i 30 dla Alw44IAFLP Rozdział na agarozie SSR 15 starterów i rozdział na żelu sekwencyjnym STS 28 starterów opcjonalnie trawienie

Podobieństwa genetyczne Dice’a F=2NXY/(Nx +NY), METODYKA: ANALIZY DNA Analiza wyników: Matryca 0 – 1 Podobieństwa genetyczne Dice’a F=2NXY/(Nx +NY), 3. Grupowanie metodą UPGMA Alba Al'bid11 Al'bi114 Alcedo Ant-Wczes' Arda ... Alba 1,000 ... Al'bid11 0,901 1,000 ... Al'bi114 0,899 0,946 1,000 ... Alcedo 0,930 0,914 0,906 1,000 ... Ant-Wczes' 0,940 0,907 0,899 0,925 1,000 ... Arda 0,949 0,891 0,895 0,910 0,926 1,000 ... … ... ... ... ... ... ... Alba Al'bid11 Al'bi114 Alcedo Ant-Wczes' Arda Aria Asta ... Pst28_2 1 0 0 1 1 1 1 1 ... Al10-9 0 1 1 0 1 0 0 0 ... gwm413_112 0 0 0 0 0 0 0 0 ... gwm400_154 0 0 0 0 0 0 0 0 ... D22_M_1400 0 0 0 0 0 0 0 1 ... Pst12_4 1 0 0 0 1 1 0 1 ... … ... ... ... ... ... ... ... ...

Wyniki: Analizy PstIAFLP i Alw44IAFLP 3/26/2017 Wyniki: Analizy PstIAFLP i Alw44IAFLP Tab. 12. Zestawienie starterów i uzyskany polimorfizm DNA po zastosowaniu metody PstIAFLP  starter mono poli PIC starter Mono Poli PIC PST01 4 4 0,263 AL1 2 2 0,152 PST02 4 9 0,339 AL2 1 0 0,000 PST03 5 9 0,268 AL3 5 5 0,043 PST04 7 8 0,278 AL4 2 4 0,176 PST05 4 4 0,275 AL5 4 5 0,120 PST06 1 6 0,174 AL6 2 0 0,000 .... .... .... … … … … … Pst26 7 4 0,274 AL28 1 3 0,172 Pst27 4 4 0,276 AL29 3 3 0,261 Pst28 4 6 0,139 AL31 1 2 0,347 Pst29 8 1 0,115 AL32 2 3 0,024 Pst30 3 3 0,212 AL34 3 1 0,116 Razem 117 129 0,202 72 139 0,121 PstI 0-9; Alw 0-18

Wyniki: Analizy PstIAFLP i Alw44IAFLP Fot.1 Polimorfizm DNA dla 82 odmian uzyskany po amplifikacji selektywnej ze starterem Pst15.

Wyniki: Analizy PstIAFLP * * * * * * * * * * * * Podobieństwo Dice’a

Wyniki: Analizy Alw44IAFLP Fot. 2. Polimorfizm DNA 82 badanych odmian pszenicy zwyczajnej uzyskany po reakcji selektywnej ze starterem AL10.

Wyniki: Analizy Alw44IAFLP Fot. 3. Polimorfizm DNA 82 badanych odmian pszenicy zwyczajnej uzyskany po reakcji selektywnej ze starterem AL16.

Wyniki: Analizy Alw44IAFLP Starter Al_27 * * * * * 79 * Podobieństwo Dice’a

Metodyka: Analizy SSR Tab. 14. Charakterystyka produktów uzyskanych dla poszczególnych starterów starter Liczba alleli zakres pz PIC PSP2999 5 145 – 153 0,579 PSP3000 9 218 –270 0,696 wms437 10 112 –174 0,794 wms415 2 135 – 137 0,457 wms294 12 66 – 112 0,828 wms312 6 192 – 221 0,750 wms190 6 204 – 216 0,474 wms257 2 195 – 197 0,511 wms304 14 204 – 226 0,895 wms533 16 81 – 129 0,759 wms46 8 168 – 182 0,800 wms325 7 147 – 165 0,763 wms120 9 125 – 160 0,760 wms413 10 92 – 114 0,721 wms400 5 134 – 154 0,723 Razem 121 0,701

Wyniki: Analizy SSR A B C Fot.4. Analizy SSR wykonane ze starterami wms46 (A); wms325 (B) i wms120 (C). A B C

Wyniki: Analizy SSR * * * * * * * * * * * * * * * *

Wyniki: Analizy STS 3/26/2017 Tab. 15. Wyniki testowania wybranych systemów na zestawie 82 odmian pszenicy zwyczajnej System polimorficzne monomorficzne PIC Wielkość (pz) ABA2 13 5 0,291 1000 – 150 ABA3 4 1 0,234 1100 – 340 ABC152 8 0 0,267 1200 – 250 ABC155 3 0 0,244 520-200 ABC158 7 2 0,208 1800 – 280 … ... ... ... ... CDO395 8 0 0,176 520 – 200 CDO541 3 0 0,160 1250-250 CDO673 1 1 0,025 300 – 200 MWG68 5 4 0,153 440 – 80 PttksuD22 10 7 0,235 1600 – 300 RAZEM: 86 44 0,202 1-13; 20 z 26

Wyniki: Analizy STS Fot .5. Polimorfizm DNA dla 48 odmian uzyskany w wyniku oznaczeń STS-PCR ze starterami BCD304 i po trawieniu enzymem MvaI (A) oraz ze starterami MWG68 po trawieniu HinfI (B). A B

Wyniki: Analizy STS * * * * * * Podobieństwo Dice’a

Wyniki: Wzajemne zależności 3/26/2017 Tabela 16. Wzajemne zależności pomiędzy podobieństwami (PG) i dystansami (DG) dla cech ilościowych, pochodzenia i markerów DNA DG_Eucl PG_COP PG_STS PG_SSR PG_Alw44IAFLP PG_PstIAFLP PG_DNA PG_COP -0,340 PG_STS 0,040 0,042 PG_SSR -0,199 0,257 0,075 PG_Alw 0,056 0,101 0,030 0,086 PG_Pst -0,150 0,213 -0,108 0,264 0,188 PG_DNA -0,387 0,338 0,132 0,558 0,403 0,641 średnia 4,667 0,078 0,862 0,293 0,915 0,920 0,624 min 1,170 0,000 0,691 0,000 0,792 0,872 0,437 max 9,992 1,000 0,966 0,933 0,974 0,984 0,929 3160

Wyniki: Selekcja markerów o istotnej korelacji z fenotypem Podobieństwo Dice’a

Wyniki: Selekcja najlepszych oznaczeń Tab. 17. Zestawienie 10 najlepszych oznaczeń skorelowanych ze średnimi wartościami cech poszczególnych plonotwórczych w grupie 82 badanych odmian pszenicy zwyczajnej Oznaczenie Przez klos kwit wys dlos likwk lizkl mzk zbit plklo MTZ bia N_ Korel N sr_2-4 _sr Pst20 0 0 0 2 3 1 1 1 4 1 0 3 16 18 4 Pst28 0 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 15 20 4 Al10 2 2 2 2 3 1 2 2 2 1 0 1 20 21 6 Al20 0 1 2 3 2 2 0 0 0 0 0 0 10 15 3 gwm294 0 1 1 2 1 1 2 0 2 0 0 1 11 15 5 gwm400 1 1 1 2 2 2 1 0 2 1 1 0 14 19 4 gwm413 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 0 0 13 22 3 gwm437 2 1 0 3 3 1 0 0 1 0 1 3 15 21 7 psp3000 0 2 3 1 1 2 0 0 2 0 0 1 12 16 5 D22 1 2 2 0 0 2 1 1 1 1 2 0 13 15 4

Wnioski Badane odmiany pszenicy zwyczajnej cechują się wysokim poziomem podobieństwa DNA. Wzajemne podobieństwo międzyodmianowe różni się w zależności od zastosowanej metody analizy DNA. Jedyne istotne zgrupowania wewnątrz analizowanych ozimych odmian pszenicy zwyczajnej uzyskano na podstawie markerów Alw44IAFLP. Pozwoliły one wyodrębnić grupę odmian z translokacją 1BL.1RS. Za pomocą analiz SSR wykazano, że większość rzadkich alleli występowała u odmian wcześnie rejestrowanych: Komorowska, Konstancja Wierzbieńska, Muras, Niewylegająca, Holme, Jasnocha Włoszanowska, Solid. Selekcja markerów skorelowanych z fenotypem pozwala na ocenę podobieństwa genetycznego przydatnego dla hodowców Zidentyfikowane markery o wysokiej korelacji z cechami ilościowymi w szerokim tle genetycznym mogą znaleźć zastosowanie w hodowli odmian o podwyższonym plonie