Metody określania struktury enzymów (część II) Enzymologia-4 Metody określania struktury enzymów (część II)

2. Określanie struktury III- i IV-rzędowej 2.1 Krystalografia i analiza rentgenograficzna białek - krystalizacja białek - aparatura rentgenograficzna - otrzymywanie danych i ich interpretacja - problem fazowy; udokładnianie struktury - rozpraszanie małokątowe (SAS) 2.2 NMR w badaniu struktury przestrzennej białek 2.3 Określanie struktury IV-rzędowej

Specyficzne cechy kryształów białek niewielkie rozmiary; zwykle < 1mm; zawierają zwykle niewiele elementów symetrii, a w konsekwecji wykazują dość proste kształty; kryształy białek są szczególnie wrażliwe i niestabilne; wynika to z dużej zawartości rozpuszczalnika (zwykle 40 – 70%); kryształy białek są wrażliwe na zmiany pH, siły jonowej, temperatury; stabilność w niskich temperaturach można poprawić poprze użycie krioprotektantów; kryształy białek często słabo rozpraszają promieniowanie rentgenowskie, z rozdzielczością niezadowalającą dla otrzymania danych strukturalnych

Składniki roztworów używanych do krystalizacji białek i warunki krystalizacji Czynniki wspomagające tworzenie kryształów: siarczan amonu, siarczan litu, siarczan magnezu, siarczan sodu, cytrynian sodu, mrówczan sodu, glikol polietylenowy 400 - 20000, 2-metylopentandiol, alkohol polywinylowy, dekstran Stabilizatory: EDTA, ditiotreitol, inhibitory proteaz, detergenty niejonowe (redukują agregację cząsteczek białka) Krioprotektant: glicerol Warunki: temperatura (zwykle 4 C, 15 C, pokojowa), pH (raczej nie pH = pI) Uwaga: warunki sprzyjające tworzeniu zarodków kryształów są często różne od tych, które sprzyjają wzrostowi kryształów Otrzymywanie kryształów kompleksów enzym:ligand współkrystalizacja enzymu z ligandem nasączanie kryształów enzymu stężonym roztworem liganda

Optymalizacja warunków krystalizacji Testy przesiewowe Metoda kropli siedzącej Metoda kropli wiszącej Mikropłytka stosowana do badań przesiewowych

Aparatura do rentgenografii strukturalnej Dyfraktometr

Wysokoenergetyczne elektrony są przyśpieszane w akceleratorze kołowym. Kształt orbity biegu elektronów jest kontrolowany przez układ magnesów. Akcelerator o promieniu 200 m umożliwia uzyskanie energii 100 GeV. Wygenerowany strumień promieni X jest wąski i ekstremalnie intensywny (~100 x ). Lokalizacja synchrotronów: USA Cornell, Stanford, Argonne, Los Alamos UK Daresbury France Grenoble (EMBL) Germany Hamburg (EMBL) Japan Photon Factory Synchrotron w Grenoble

W klasycznym układzie pomiarowym kryształ jest obracany powoli, prostopadle do monochromatycznej wiązki promieni X. Kryształ umieszczony na pętli włókna Kryształ białka w równowadze z ciekłym rozpuszczalnikiem w cienkościennej kapilarze.

Detektory promieniowania X Błona fotograficzna Charge-coupled device (CCD) Płyta Detektor FAST

W niższej temperaturze zwiększa się stopień uporządkowania

Dyfrakcja promieni X - zasady Prawo Bragga 2d sin = 

Rozwiązywanie problemu fazowego metodą MIR Z eksperymentu otrzymuje się: fazę + amplitudę fali rozpraszanej przez atom metalu, amplitudę dla samego białka i amplitudę dla kompleksu białko/metal; - można obliczyć, czy interferencja promieni X rozpraszanych przez metal i białko ma charakter wzmocnienia czy wygaszenia; można oszacować fazę dla białka. Niestety dwa rożne kąty fazowe dają równie dobre rozwiązanie, więc zachodzi konieczność wykorzystania drugiego kompleksu z metalem ciężkim. Tylko jeden z dwóch kątów fazowych z drugiego zestawu danych będzie miał tą samą wartość co jeden z dwóch wyznaczonych poprzednio.

Inna możliwość: Podstawienie molekularne (MR) Zastosowanie możliwe, gdy są znane dokładne struktury białek podobnych Niezbędne elementy: zestaw wartości |F0(hkl)| dla kryształu białka (struktura docelowa); koordynaty struktury białka (struktura pomocnicza) podobnego do białka docelowego; odpowiedniej jakości komputer + oprogramowanie Metoda polega na wielokrotnym, sekwencyjnym ilościowym porównaniu tzw. funkcji Pattersona modelu docelowego i pomocniczego.

(a) Mapa o niskiej rozdzielczości (5 Å lub więcej – ogólny kształt cząsteczki; (b) Mapa o średniej rozdzielczości (~3 Å) – przebieg łańcucha polipeptydowego możliwość dopasowania znanej sekwencji aminokwasowej do mapy; (c) Mapa o wysokiej rozdzielczosci (1.5 - Å) – jednoznaczna identyfikacja reszt aminokwasowych; (d) Mapa o bardzo wysokiej (atomowej) rozdzielczości (poniżej 1 Å) – atomy jako izolowane kuleczki gęstości elektronowej Rozdzielczość danych dyfrakcyjnych zależy od wielkości kryształu i stopnia jego uporządkowania

Metody rozpraszania małokątowego - małokątowe rozpraszanie promieni X (SAXS) - małokątowe rozpraszanie neutronów (SANS) Promienie X lub neutrony są rozpraszane pod kilkoma niewielkimi kątami. Eksperyment przeprowadzany jest w roztworze! Intensywność rozpraszanego promieniowania as a function of scattering angle. mierzy się w w funkcji kąta rozpraszania. Eksperymentalnie otrzymaną zależność porównuje się z zależnością wyliczoną teoretycznie dla proponowanej struktury modelowej.

Zastosowanie NMR do badania struktury białek Widmo 1H NMR niewielkiego białka (< 15 kDa)

Spektroskopia NMR Schemat budowy spektrometru NMR Podstawa metody: zjawisko magnetyzmu jądrowego Zasada metody: Znajdujące się w zewnętrznym polu magnetycznym jądra atomów posiadające moment magnetyczny (np. 1H, 19F, 14N, 15N, 13C), na które działa promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości radiowej, absorbują kwanty energii tego promieniowania, przechodząc na wyższy poziom energetyczny. Absorpcję tą określa się jako jądrowy rezonans magnetyczny. Absorpcja energii uwidacznia się jako układ linii spektralnych – sygnałów rezonansowych. Schemat budowy spektrometru NMR

2D NMR

2D NMR Przekątna sygnałów (A i B) dzieli widmo na dwie równe połowy. Symetrycznie do tej przekątnej, znajdują się Kolejne sygnały (X), nazywane sygnałami krzyżowymi. Sygnały na przekątnej wynikają z magnetyzacji, która nie została zmieniona przez sekwencję miksującą (równe częstotliwości w obu kierunkach), tzn. z wkładów, które pozostają na tych samych jądrach podczas obu okresów ewolucji. Sygnały krzyżowe pochodzą od jąder, które wymieniły magnetyzację podczas okesu zmieszania (częstotliwości pierwszego i drugiego jądra w każdym kierunku). Sygnały te wskazują na oddziaływania między tymi jądrami.

2D NMR

2D NMR COSY TOCSY W eksperymencie COSY magnetyzacja jest przenoszona poprzez sprzężenie skalarne. Protony, które są rozdzielone więcej niż trzema wiązaniami chemicznymi nie dają sygnałów krzyżowych, bowiem stałe sprzężenia 4J są bliskie 0. tak więc, tylko sygnały pochodzące od protonów rozdzielonych dwoma lub trzema wiązaniami występują w widmie COSY (czerwone). Szczególne znaczenie mają sygnały krzy żowe pochodzące od protonów HN i Halpha ponieważ na podstawie stałych sprzężenia 3J między nimi można określić kąty torsyjne phi szkieletu łańcucha polipeptydowego białka. W ekspermencie TOCSY, magnetyzacja jest rozproszona na cały układ spinowy reszty amiokwasowej w wyniku kolejnych sprzężeń skalarnych. W widmie TOSCY występują zatem nie tylko sygały czerwone (to te same co w widmie COSY), lecz także dodatkowe sygnały (zielone), które są wynikiem oddziaływań wszystkich protonów układu spinowego.

2D NMR białek Glicyna (z lewej strony) posiada dwa protony Halpha , może być zatem łatwo zidentyfikowana. Walinę (z prawej), leucynę and isoleucynę można łatwo rozróżnić na podstawie sygnałów ich dwóch grup metylowych, które dają characteristyczny układ podwójnych sygnałów między 0 a 1.5 ppm. W podobny sposób można zidentyfikować reszty alaniny i treoniny.

NOESY Eksperyment NOESY ma kluczowe znaczenie dla określania struktury białka. W technice tej wykorzystuje się dipolowe oddziaływania spinowe (jądrowy efekt Overhausera, NOE) dla korelacji protonów. Intensywność NOE jest w pierwszym przybliżeniu proporcjonalna do 1/r6, gdzie r to odległość pomiędzy Protonami. W praktyce sygnały są obserwowane, gdy r < 5 Å. W eksperymencie NOESY można obserwować sygnały protonów, które znajdują się daleko od siebie w sekwencji aminokwasowej, lecz Blisko w przestzeni, z uwagi na ułożenie łańcucha w trzeciorzędowej strukturze białka.

2D NMR białek Sekwencyjny kontakt reszt aminokwasowych można określić na podstawie 2D widma NOESY . Jest to możliwe, ponieważ odległość protonu amidowego reszty (i + 1) od protonów ,  i  reszty (i ) jest prawie zawsze mniejsza niż 5 A. Sekwencyjne sygnały krzyżowe Halpha(i), Hbeta(i), Hgamma(i), etc. są obserwowane przy częstotliwości HN(i+1) (ciemnoniebieskie). Sgnały te można odróznić Od sygnałów wewnątrz reszty poprzez porównaie widm NOESY i TOCSY. Zestaw sekwencyjnych sygnałów krzyżowych pomiędzy Halpha(i) i HN(i+1) określa kolejność i, i+1, i+2,... reszt aminokwasowych w łańcuchu.

2D heterojądrowy NMR białek Oprócz protonów białka zawierają także inne aktywne magnetycznie jądra. Dla celów spektroskopii NMR wyjątkowe znaczenie mają jądra 15N i 13C, szczególnie dla określania struktury większych białek (> 100 AA). Ponieważ jednak naturalna częstotliwość występowania jąder 15N and 13C jest bardzo niska, a właściwości magnetyczne dużo mniej korzystne niż jąder 1H, stosuje się dwa podejścia: wzbogacenie udziału izotopowego jąder 15N i 13C w cząsteczkach badanego białka oraz wzmocnienie stosunku sygnału do szumów poprzez wykorzystanie techniki inwersyjnego 2D NMR, w której magnetyzacja przenoszona jest od 1H do 15N lub 13C. . Najważniejszą wersją inwersyjnego NMR jest HSQC (heteronuclear single quantum correlation). Zasada metody na schemacie powyżej. W metodzie tej następuje korelacja atomu azotu grupy NHx z protonem połączonym z tym atomem. Każdy sygnał w widmie HSQC odpowiada protonowi połączonemu z atomem azotu.

Etapy odczytywania struktury białka z widma 2D NMR

Struktura białka wynikająca z widma NMR to zestaw konformacji o minimalnych energiach.

Spektroskopia NMR dużych białek – TROSY Transverse Relaxation-Optimised SpectroscopY Zastosowanie techniki TROSY pozwala na wyeliminowanie poprzecznej relaksacji spinu jądrowego, która jest bezpośrednią przyczyną rozmycia i zlewania się sygnałów w widmach 2D NMR dużych białek

Wzrost ilości rozwiązanych struktur białek i kwasów nukleinowych w latach 1972-2004

Określanie czwartorzędowej struktury białka Porównanie wielkości MW białka natywnego (chromatografia rozmiarów wykluczających, ultrawirowanie) oraz zdenaturowanego (SDS-PAGE ) 2. Sieciowanie białka Sieciowane białek w wyniku działania diestru metylowego kwasu suberowego sieciowanie; b. analiza SDS-PAGE 3. Określanie stechiometrii wiązania ligandów