Antygeny otrzymane T. gondii w Katedrze Mikrobiologii

Diagnostyka toksoplazmozy Metody diagnostyczne powinny: potwierdzić lub wykluczyć zarażenie T. gondii; określić fazę zarażenia (toksoplazmoza wczesna, przewlekła); u kobiet w ciąży z pierwotną toksoplazmozą potwierdzić lub wykluczyć zarażenie płodu lub noworodka METODY BEZPOŚREDNIE (mają na celu izolację pasożyta lub wykrycie jego antygenu) POŚREDNIE (wykorzystują właściwości immunogenne pasożyta)

Testy serologiczne stosowane w diagnostyce toksoplazmozy Test barwny (antygen żywy / IgG) Immunofluorescencja pośrednia (antygen utrwalony formaliną / IgG, IgM) Aglutynacja bezpośrednia (antygen utrwalony formaliną / IgG + IgM) Test ISAGA (antygen utrwalony formaliną / IgM, IgA, IgE) Odczyn wiązania dopełniacza (antygen cytoplazmatyczny / IgG + IgM) Test hemaglutynacji (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG + IgM) Test ELIFA (antygen cytoplazmatyczny / IgG, IgM, IgA, IgE) Awidność przeciwciał (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) Test ELISA: pośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) bezpośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgM i IgA)

Schemat reakcji PCR (amplifikacja DNA genu bag1) ekson 1 ekson 2 ekson 3 ekson 4 ex1 ex2 PCR 1 279 pz ex3 PCR 2 232 pz ex4 PCR 3 243 pz ex3 ex4 PCR 4 437 pz

Konstrukcja plazmidu rekombinantowego ex1 ex2 MCS pUC19 2686 pz EcoRI SmaI EcoRI Produkt PCR 1 EcoRI / SmaI pUC19/ex1ex2 2943 pz HindIII Produkt PCR 4 ex3 ex4 CCT CCC CCC GGG Pro Pro Pro SmaI SmaI / HindIII pUC19/BAG1 3080 pz

Konstrukcja plazmidu rekombinantowego pUC19/BAG1 3080 pz BglII / HindIII MCS pUET1 2856 pz BglII HindIII bag1 (694 pz) Klonowanie do wektora ekspresyjnego pUET1 w miejsca restrykcyjne BglII i HindIII DNA produktu PCR pUET1/BAG1 3465 pz

Immunoidentyfikacja i oczyszczanie rekombinantowego białka BAG1 Rys. (A) Wynik testu Western blotting z użyciem przeciwciał skierowanych na domenę S-Tag; (B) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach zebranych lizatów w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE); (C) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach uzyskanych podczas oczyszczania białka rekombinantowego BAG1 w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE).

Antygeny powierzchniowe (SAG) RODZINA NAZWA FORMA ROZMOJOWA MARKER TEST Antygeny powierzchniowe (SAG) SAG1-His SAG2-His SAG4-His P35-His BSR4-His tachyzoit tachyzoit / bradyzoit bradyzoit w / p późna wczesna ELISA / Western b. Western blotting Antygeny granul o dużej gęstości (GRA) GRA1-His GRA2-His / GRA2ex2 GRA4-His GRA5-His / GRA5-Trx GRA6-His GRA7-His GRA9-His Antygeny roptrii (ROP) ROP1-His ROP9-His nie badano - Antygeny mikronem (MIC) MIC1-His MIC3-His / MIC3-Trx Enzymy LDH1-His LDH2-His Inne MAG1-His BAG1-His

Test Western blotting M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – GRA5 3 – GRA9 4 – GRA4 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) IgM +, IgG + / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła ??? M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła IgM -, IgG 48 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła

Toksoplazmoza wczesna (ostra) Toksoplazmoza przewlekła Test Western blotting M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M – marker wielkości 1 – MIC3 2 – MAG1 3 – SAG4 4 – p35 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła

TOKSOPLAZMOZA WCZESNA Test Western blotting 1 PACJENT M 1 2 3 M 1 2 3 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – p35 3 – SAG4 1 pobranie surowicy TOKSOPLAZMOZA WCZESNA 2 pobranie surowicy (8 miesięcy później) TOKSOPLAZMOZA PÓŹNA

DNA szczepionki

DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek Ściśle zdefiniowany skład zawierają geny kodujące określone antygeny białkowe lub sekwencje kodujące determinanty antygenowe Bezpieczeństwo brak możliwości wywołania infekcji możliwość wywołania choroby autoimmunologicznej indukcja produkcji autoprzeciwciał skierowanych przeciwko komórkom, w których następuje biosynteza obcego antygenu możliwość integracji DNA plazmidowego z ludzkim DNA Skuteczność wywołują zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź immunologiczną uzależniona od rodzaju kodowanego antygenu uzależniona od poziomu ekspresji antygenu w komórce docelowej

DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek możliwość stosowania tylko jednej dawki szczepionki długotrwała prezentacja antygenu systemowi immunologicznemu – biosynteza antygenu in vivo możliwość stosowania jako szczepionki profilaktyczne lub terapeutyczne ochrona przed infekcją stymulacja układu immunologicznego u osobników zainfekowanych możliwość stosowania u niemowląt posiadających jeszcze matczyne przeciwciała DNA plazmidowe nie jest rozpoznawane i neutralizowane przez przeciwciała długotrwała prezentacja antygenu umożliwia rozwój prawidłowej odpowiedzi immunologicznej możliwość wywoływania odporności na różne szczepy tego samego wirusa lub bakterii możliwość wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bardziej zakonserwowanym antygenom niż antygeny powierzchniowe

DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek Możliwość stosowania jako szczepionki skojarzone lub poliwalentne kilka plazmidów kodujących różne antygeny jeden plazmid kodujący kilka antygenów Możliwość dostarczania DNA do organizmu różnymi sposobami Łatwa formulacja szczepionek brak konieczności stosowania adiuwantów, substancji konserwujących i stabilizujących Stabilność termiczna liofilizowane lub sprecypitowane DNA można bardzo długo przechowywać w temperaturze pokojowej Niski koszt produkcji możliwość produkcji dużych ilości plazmidowego DNA w komórkach bakteryjnych łatwa i tania procedura oczyszczania plazmidowego DNA - liza alkaliczna

DNA szczepionki Sposoby formulacji i podawania szczepionek DNA domięśniowo (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) wydajność dostarczania DNA wzrasta, jeżeli jest podawane do regenerujących się mięśni śródskórnie (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) dożylnie (iniekcja, DNA wewnątrz liposomów) przez błony śluzowe donosowo; DNA w roztworze soli fizjologicznej, w postaci aerozolu doustnie; mikrokapsułki z biodegradowalnych polimerów zawierające DNA przez skórę skaryfikacja; DNA w roztworze soli fizjologicznej dostarczanie za pomocą pistoletu genowego, cząsteczki złota opłaszczone DNA (DNA dostarczane bezpośrednio do wnętrza komórek)

DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) bakteryjne ori replikacji zapewnia dużą liczbę kopii plazmidowego DNA w komórce bakteryjnej prokariotyczny marker selekcyjny umożliwia łatwą identyfikację komórek bakteryjnych transformowanych DNA plazmidowym miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) umożliwia łatwe wprowadzenie genu kodującego antygen w obręb DNA plazmidowego

DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) elementy regulujące transkrypcję w organizmach eukariotycznych silne promotory pochodzenia eukariotycznego lub wirusowego promotor CMV ludzkiego wirusa cytomegalii promotor SV40 małpiego wirusa S40 promotor CKM mięśniowo-specyficznej kinazy kreatyny eukariotyczne lub wirusowe terminatory transkrypcji zapewniające poliadenylację mRNA sygnał poliadenylacji wirusa S40 sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH)

Odpowiedź immunologiczna indukowana przez szczepionki DNA

DNA szczepionki Możliwości zwiększenia skuteczności szczepionek DNA zwiększenie poziomu ekspresji genu kodującego antygen nowe silne promotory promotory tkankowo-specyficzne sekwencja Kozaka inicjacji translacji w komórkach eukariotycznych (-6GCCAGCCAUGGG+4) codon usage – stosowanie kodonów preferowanych przez komórki ssacze multimeryzacja genu kodującego antygen zwiększenie immunogenności DNA szczepionki wprowadzenie do wektora plazmidowego immunogennych sekwencji CpG koekspresja antygenu z cząsteczkami immunostymulującymi

Szczepionki DNA poddawane próbom klinicznym Patogen Kodowane białko Odpowiedź humoralna Odpowiedź komórkowa HIV gp160, białka regulatorowe, białka rdzenia, enzymy nie badano + HBV HBsAg HSV glikoproteina HSV w ocenie wirus grypy hemaglutynina Plasmodium sp. CSP, Spf66

Metody genotypowe najczęściej stosowane w badaniach epidemiologicznych Makrorestrykcyjna analiza genomowego DNA połączona z elektroforezą pulsacyjną (REA/PFGE) Multilocus Sequence Typing (MLST) Mikromacierze DNA Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego DNA (PCR/RFLP) Repetytywny ekstrageniczny palindromowy PCR (Rep-PCR) Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA (RAPD) Rybotypowanie Metody oparte o ligację adaptorów Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego komórki

w typowaniu mikroorganizmów” „Złoty standard” w typowaniu mikroorganizmów” Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową (RFLP-PFGE) Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej jest obecnie metodą standardową w epidemiologii szpitalnej.

Krawczyk, B. , Lewandowski, K. , Bronk, M. , Samet, A. , Myjak, P Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A., Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Meth. 52 (2003) 341-351. Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury i zachowania stałych warunków analizy.

Cechy efektywnej metody typowania szczepów: • Wysoki stopień dyskryminacji • Powtarzalność • Zdolność do typowania wszystkich szczepów • Prosta w użyciu • Szybkość • Mało kosztowna • Wystandaryzowana Potrzeba poszukiwania nowych metod typowania genetycznego, które powinny charakteryzować się prostotą wykonania, porównywalną siłą dyskryminacji do RFLP/PFGE, niskimi kosztami oraz łatwością adaptacji do badań rutynowych

METODY FINGERPRINTING Wiele obecnie stosowanych technik typowania molekularnego opiera się na analizie całego genomowego DNA Metody te wykorzystują: analizę restrykcyjną amplifikację fragmentów DNA in vitro, przy zastosowaniu reakcji PCR Rozdział powstałych fragmentów DNA o różnej długości uzyskuje się przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prążków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Różnice we wzorach świadczą o odmienności genetycznej badanych organizmów.

wzór elektroforetyczny = „odcisk palca”

Metody typowania molekularnego oparte na technice ang Metody typowania molekularnego oparte na technice ang. Ligation Mediated PCR AFLP- Amplified Fragment Length Polymorphism, IRS- PCR – Infrequent Restriction Site PCR, ADSRRS- fingerprinting – Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites PCR- MP – PCR Melting Profiles.

LM PCR (ang. Ligation – Mediated Polimerase Chain Reaction) Technika ta umożliwia analizę całego genomowego DNA zarówno prokariotycznego jak i eukariotycznego, bez potrzeby znajomości jego sekwencji Etapy: trawienie restrykcyjne ligacja adaptorów reakcja pre –PCR reakcja PCR elektroforeza produktów amplifikacji

Trawienie restrykcyjne 5’ - P G GATC C 5’ - P G GATCC 5’ - P G GATCC G GATCC C CTAG G CCTAG G - 5’ P CCTAG G - 5’ P CCTAG G - 5’ P

Ligacja adaptorów oligonukleotydowych CTAG 5’ - CTAG - 5’ 5’ - P GATC CTAG P - 5’

Ligacja adaptorów oligonukleotydowych CTAG 5’ - P GATC CTAG CTAG 5’ - - 5’ P - 5’

Ligacja adaptorów oligonukleotydowych CTAG P GATC CTAG CTAG P

Ligacja adaptorów oligonukleotydowych GATC CTAG CTAG CTAG

Reakcja pre - PCR GATC CTAG CTAG CTAG

Reakcja PCR GATC CTAG

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym 1 2 3

Td [ºC] 75 100

Td [ºC] 75 100

PCR MP – PCR Melting Profile Ograniczoną reprezentację genomu można otrzymać stosując LM PCR z niższą niż zwykle temperaturą denaturacji w trakcie reakcji PCR

PCR MP- cechy Zalety: Metoda nie wymaga znajomości analizowanej sekwencji; Prosta analiza wyników rozdziału w żelu poliakryloamidowym wybarwionych bromkiem etydyny; Ten sam adaptor i enzym restrykcyjny może być użyty do analizy DNA różnych gatunków organizmów; Wysoki potencjał różnicujący; Metoda szybka i stosunkowo tania ; Bardzo dobra powtarzalność uzyskiwanych wyników; Wady: Termocykler gradientowy; Kalibracja termocyklera;

PCR MP - PCR Melting Profile Etap wstępny Gradient temperatury denaturacji Wybór odpowiedniej temperatury denaturacji 87,7oC

PCR MP w wykrywaniu zakażeń szpitalnych na poszczególnych oddziałach szpitala Krawczyk, B., Samet, A., Leibner, J., Śledzińska, A., Kur, J.: Evaluation of a PCR melting profile (PCR MP) technique for bacterial strain differentiation. J. Clin. Microbiol. 44 (2006) 2327-2332. H2

PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Sytuacja epidemiologiczna indywidualnego pacjenta Nr pacjenta Data Materiał Genotyp 6 23.09. 04 krew H1 05.02. 05 H11 H12 H13 07.02. 05 kał 10.05. 05 H19 19.05.05 22.05.05 H24 25.05.05 27.05.05 08.07.05

PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii Co to jest translokacja bakterii? migracja bakterii pochodzących z prawidłowej flory bakteryjnej i ich toksyn przez ścianę przewodu pokarmowego i układu moczowego, co w konsekwencji może wywoływać bakteriemię, zakażenia narządowe, a nawet posocznicę oraz zapalenie otrzewnej u chorych z marskością wątroby.

PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii UG1 mocz 03.05.05 68 krew 40 67 11 IM1 kał 13.02.05 34 22 12.02.05 33 10 T4 04.03.05 53 31 03.03.05 52 9 H9 02.01.05 29 17 01.01.05 28 8 H17 25.02.05 46 26 22.02.05 45 7 P1 15.12.04 24 15 14.12.04 23 6 T2 15.02.05 37 36 35 5 T1 12.11.04 2 1 4 H15 18.02.05 39 3 H20 10.05.05 70 69 H13 07.02.05 13 12 Genotyp Źródło izolacji Nr pacjenta Data izolacji Nr izolatu Nr translokacji

PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii Gradient temperatury denaturacji Potwierdzenie pokrewieństwa genetycznego

Optymalizacja procedury PCR MP dla Enterococcus faecium Optymalizacja - cykl badań, który pozwoli określić parametry krytyczne poszczególnych etapów metody oraz wyznaczyć ich wartości optymalne Cel optymalizacji: skrócenie czasu przeprowadzania badania zmniejszenie stopnia skomplikowania przeprowadzania badania obniżenie kosztów analizy z zachowaniem jakości i powtarzalności otrzymywanych wyników

W wyniku optymalizacji PCR MP określono: Izolacja genomowego DNA Enterococcus faecium Podczas optymalizacji PCR MP badano wpływ zmiany: ilości, rodzaju i stężenia stosowanych odczynników czasu trwania poszczególnych etapów temperatury poszczególnych etapów na jakość otrzymywanych wyników Trawienie restrykcyjne genomowego DNA Reakcja ligacji Inaktywacja termiczna W wyniku optymalizacji PCR MP określono: parametry krytyczne metody wartości optymalne badanych parametrów Reakcja PCR Elektroforeza poliakrylamidowa Wizualizacja

Wyznaczenie parametrów krytycznych Wyznaczenie ilości mieszaniny ligacyjnej w reakcji PCR M 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 3 4 5 6 10 Wyznaczenie aktywności enzymu restrykcyjnego M 0.1 0.5 1 2 3 4 5 10 K- Rys.1. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości enzymu restrykcyjnego w reakcji trawienia; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.1 – 10 –ilości enzymu w kolejnych próbach Rys.2. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości mieszaniny ligacyjnej; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.2 – 10 – objętość mieszaniny ligacyjnej w kolejnych próbach [ul]

Procedura zoptymalizowana Procedura skrócona (wg Krawczyk B., Samet A., Leibner. J, Śledzińska A. Kur J. (2006); Izolacja genomowego DNA Enterococcus faecium Procedura zoptymalizowana 1h; 37°C 500 ng DNA 5U HindIII 20 min; 37°C 600 - 1000 ng DNA 3U Hind III Trawienie restrykcyjne genomowego DNA 1h, 16°C adaptor: 20pmol każdego oligonukleotydu 1U ligazaT4 20min; 16°C adaptor: 10pmol każdego oligonukleotydu 0,6U ligazaT4 Reakcja ligacji 10 min; 70°C Inaktywacja termiczna Vc= 25 μl mieszanina ligacyjna 1μl starter 25 pmol Polimeraza PwoHis 0.6 U Cykle: 22 Vc= 25 μl mieszanina ligacyjna 1μl starter 25 pmol Polimeraza PwoHis 0.6 U Cykle: 22 10 min; 70°C Reakcja PCR Elektroforeza poliakrylamidowa Wizualizacja

? Weryfikacja zoptymalizowanej procedury PCR MP Procedura standardowa Procedura zoptymalizowana M1 1 2 3 4 5 M2 1 2 3 4 5 Parametr Skrócona procedura PCR MP Zoptymalizowana procedura PCR MP czas badania 8 h 6-7h koszt badania ? Zredukowany ze względu na zmniejszenie ilości stosowanych odczynników jakość otrzymywanych wyników bardzo dobra interpretacja wyników łatwa Analiza porównawcza pięciu różnych szczepów E. faecium

Konstrukcja zestawu diagnostycznego PCR MP unique Zestaw diagnostyczny PCR MP unique wykorzystuje zoptymalizowaną technikę PCR MP Służy do różnicowania i genotypowania drobnoustrojów w badaniach epidemiologicznych Zestaw pozwala na przeprowadzenie 100 pełnych analiz, przy zastosowaniu gotowych do użycia odczynników o stężeniach i aktywnościach odpowiadającym optymalnym

Walidacja zestawu diagnostycznego PCR MP unique Walidacja dowolnej metody badawczej jest to działanie mające na celu potwierdzenie w sposób udokumentowany i zgodny z założeniami, że dana metoda badawcza jest odpowiednia dla zamierzonego celu i pozwala uzyskać zaplanowane (prawidłowe) wyniki z odpowiednią precyzją i dokładnością. Walidacja przeprowadzona zgodnie z wytycznymi ICH (The International Conferencer on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) oraz monografii EP (European Pharmacopeia) dla metod analitycznych, wykorzystujących techniki amplifikacji kwasów nukleinowych (NAT – Nucleic Acid Amplification Techniques)

Cechy walidowane: specyficzność i selektywność granica wykrywalności elastyczność powtarzalność precyzja otrzymywanych wyników

Precyzja odtwarzalność Stopień zgodności otrzymanych wyników, gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtórzonych, niezależnych oznaczeń. Miarą precyzji jest stopień zgodności profili elektroforetycznych produktów reakcji PCR otrzymanych na drodze niezależnych badań tego samego szczepu. powtarzalność M 1 2 3 4 K- M 1 2 3 4 K- M 1 2 3 4 K- Precyzja oznaczeń wykonanych przez tą samą osobę w tym samym laboratorium na tej samej aparaturze oraz z wykorzystaniem tych samych odczynników w krótkim odstępie czasu 23.01.2007 6. 02.2007 20. 02. 2007 odtwarzalność Precyzja oznaczeń wykonywanych przez: inną osobę w tym samym laboratorium stosując te same odczynniki i aparaturę

Walidacja zestawu diagnostycznego PCR MP unique - podsumowanie Zoptymalizowana procedura PCR MP jest: specyficzna selektywna charakteryzuje się granicą oznaczalności DNA w ilości 250 ng elastyczna uniwersalna

ADSRRS fingerprinting (ang ADSRRS fingerprinting (ang. Amplification of DNA Surrounding Rare Restriction Sites) Zjawisko supresji

Oznaczenie rodziny/pacjenta Badania relacji epidemiologicznych pomiędzy nosicielstwem Staphylococcus aureus a czyracznością (metoda ADSRRS) Numer izolatu Oznaczenie rodziny/pacjenta Źródło izolacji PCR MP genotyp 1 I/A nos A’ 2 I/B 3 czyrak 4 II/A B’ 5 6 II/B C’ 7 III/A D’ 8 III/B 9 10 czyrak (pacha) 11 IV/A E’ 12 IV/B F’ 13

Nowa klasa homodimerycznych białek SSB z rodziny Deinococcaceae /Thermaceae – charakterystyka molekularna, zastosowanie

SSB (ang. single stranded DNA - binding protein) białka wiążące się z jednoniciowym DNA Funkcje białek SSB są niezbędne w procesie replikacji DNA stymulują polimerazy DNA oddziaływują z innymi białkami replikacyjnymi (np. helikazą) biorą udział w rekombinacji i naprawie DNA Występowanie białek SSB wszystkie żywe organizmy wirusy mitochondria

Klasyfikacja białek SSB ze względu na budowę ► homotetramer: - większość bakterii - mitochondria ► heterotrimer: - archaea - eukaryota ► dimer: - Thermus thermophilus (263 aa) - Thermus aquaticus (264 aa) - Deinococcus radiodurans (301 aa)

Termostabilność TaqSSB i TthSSB T.aquaticus i T. thermophilus rosną w optymalnej temp. 70ºC Termostabilność białek TaqSSB i TthSSB w T = 85ºC okres półtrwania wynosi 10 min

Termostabilność DgeoSSB i DmurSSB DmurSSB 49,51kDa monomer: 276 aa DgeoSSB 61,93 kDa monomer: 300 aa

Zastosowanie białek TaqSSB i TthSSB w reakcji PCR…i nie tylko…

Aplikacje białek SSB Zastosowanie białek TaqSSB i TthSSB Reakcje PCR Inne techniki wykorzystujące ssDNA i RNA Reakcje PCR Reakcja multipleks PCR Reakcje sekwencjonowania trudnych matryc Odwrotna transkrypcja (RT) Legenda: Zastosowanie dowiedzione Zastosowanie potencjalne

Reakcja PCR – jedną z najbardziej popularnych aplikacji termostabilnych białek SSB Wykorzystaliśmy białko TthSSB i TaqSSB do amplifikacji fragmentu DNA wirusa CMV. Rozdział elektroforetyczny w 2% żelu agarozowym produktów reakcji PCR przeprowadzanej w nieobecności TthSSB (góra) lub z białkiem TthSSB (dół). Powyżej ścieżek wskazano liczbę cząsteczek DNA (pCDNA21/CMV) w każdej amplifikowanej próbce. Rezultat: TthSSB podnosi wydajność reakcji PCR o 4 rzędy wielkości

Wykorzystanie białka TaqSSB w reakcji multipleks PCR ► Krótkie tandemowe sekwencje repetytywne występujące w ludzkim chromosomie Y (Y-STR) wykazują wysoki stopień polimorfizmu i są znacznikiem różnicującym osobniki. Analiza polimorfizmu ludzkiego Y-STR umożliwia ustalenie ojcostwa i jest szeroko stosowana w laboratoriach medycyny sądowej. Loci DYS390, DYS392 i DYS393 występujące w Y-STR są dobrym markerem różnicującym ► W Zakładzie Medycyny Sądowej AM Gdańsk badano wpływ białka TaqSSB na amplifikację multiplex PCR z dimeryzacją starterów. Do badania wpływu białka TaqSSB na efektywność amplifikacji układu wybrano amplifikację dupleksu DYS390-DYS392, w której dimeryzacja starterów zachodzi w trakcie procesu i powstaje nieprawidłowy produkt PCR długości 36 pz, uniemożliwiający syntezę właściwych produktów PCR w standardowych warunkach Hybryd utworzony przez startery DYS390 i DYS392 starter DYS390 starter DYS392 3’ 5’

Wynik reakcji multiplex PCR Startery DYS390 = A Startery DYS392 = B Startery DYS393 = C M – wzorzec wielkości DNA (pGEM, Promega) 1 - produkty amplifikacji ze starterami C-A+TaqSSB 2 - produkty amplifikacji ze starterami C-A 3 - produkty amplifikacji ze starterami C-B+TaqSSB 4 - produkty amplifikacji ze starterami C-B 5 - produkty amplifikacji ze starterami A-B+TaqSSB 6 - produkty amplifikacji ze starterami A-B 7 - produkty amplifikacji ze starterami A-B-C+TaqSSB 8 - produkty amplifikacji ze starterami A-B-C

Wnioski dotyczące reakcji PCR DYS390, DYS392 i DYS393 ► Startery DYS390 i DYS392 tworzą bardzo stabilną hybrydę, łącząc się ze sobą na 3’ końcach, do których polimeraza dosyntetyzowuje nukleotydy i tworzy się dodatkowy produkt o wielkości 36 pz. ► Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wnioskować, że dodatek termostabilnego białka SSB uniemożliwia tworzenie się struktur drugorzędowych, zarówno wewnątrzcząsteczowych, jak i międzycząsteczkowych, dzięki czemu, uzyskuje się większą wydajność reakcji PCR, a tym samym pozwala na uzyskanie oczekiwanego produktu reakcji PCR.

Wpływ białka TaqSSB na reakcję PCR Wynik reakcji PCR modelowego układu, w którym startery wiążą się ze sobą na końcach 3’ 5’ CGACGATTCTGAGTACTTGCA 3’ 3’ AGACTCATGAACGTAGCAGCA 5’ M – marker wielkości M100-500 1 – reakcja bez białka TaqSSB 2 – reakcja z dodatkiem 6l białka TaqSSB 3 – reakcja z dodatkiem 8l białka TaqSSB 4 – reakcja z dodatkiem 9l białka TaqSSB 5 – reakcja z dodatkiem 10l białka TaqSSB 6 – reakcja z dodatkiem 11l białka TaqSSB 7 – reakcja z dodatkiem 12l białka TaqSSB 8 – reakcja z dodatkiem 14l białka TaqSSB stężenie białka TaqSSB – 1.12 g/l Dodatek innych znanych „wzmacniaczy” reakcji PCR jak np.: EcoSSB/Formamid/TMAC/DMSO/TritonX-100 nie przyniósł satysfakcjonujących rezultatów !!!