Polymerase Chain Reaction

Prezentacja na temat: "Polymerase Chain Reaction"— Zapis prezentacji:

1 Polymerase Chain Reaction
Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain reaction (PCR) It was developed by Kary Mullis in 1985 Unlike gene cloning, PCR can copy DNA without the aid of vectors and host cells 18-38 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

2 Hot water bacteria: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase
Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science

3 The starting material for PCR includes
1. Template DNA Contains the region that needs to be amplified 2. Oligonucleotide primers Complementary to sequences at the ends of the DNA fragment to be amplified These are synthetic and about nucleotides long 3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) Provide the precursors for DNA synthesis 4. Taq polymerase DNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticus This thermostable enzyme is necessary because PCR involves heating steps that inactivate most other DNA polymerases 18-39 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

4 Example thermal cycler protocol used in lab:
Step 1 7 min at 94˚C Initial Denature Step 2 45 cycles of: 20 sec at 94˚C Denature 20 sec at 52˚C Anneal 1 min at 72˚C Extension Step 3 7 min at 72˚C Final Extension Step 4 Infinite hold at 4˚C Storage BIOL 362 samples processed in: MJ Research DNA Engine Dyad

5 DNA primers for PCR 5’-AAGCGATGACAAGATCAACAGCTGATCGATCGT-3’
3’-TTCGCTACTGTTCTAGTTGTCGACTAGCTAGCA-5’ 5’-AAGCGATGA Primer 1 (sense) CTAGCTAGCA-5’ Primer 2 (antisense) Primers are generally designed to have a Tm of ~55°C - Tm = temperature at which 50% of duplex is denatured More G/C base pairs = higher Tm 100% % single stranded 50% Tm ~95° C temperature

6 Binding of the primers to the DNA is called annealing
PCR is carried out in a thermocycler, which automates the timing of each cycle All the ingredients are placed in one tube The experimenter sets the machine to operate within a defined temperature range and number of cycles 18-40

7 The sequential process of denaturing-annealing-synthesis is then repeated for many cycles
With each successive cycle the relative amount of this type of DNA fragment increases. Therefore, after many cycles, the vast majority of DNA fragments only contain the region that is flanked by the two primers A typical PCR run is likely to involve 20 to 30 cycles of replication This takes a few hours to complete After 20 cycles, a DNA sample will increase 220-fold (~ 1 million-fold) After 30 cycles, a DNA sample will increase 230-fold (~ 1 billion-fold) 18-41

8 The PCR reaction shown in Figure 18
The PCR reaction shown in Figure 18.6 seeks to amplify a specific DNA segment For this type of experiment, a researcher must have prior knowledge about the sequence of the template DNA This, in order, to construct the synthetic primers PCR can also be used to amplify chromosomal DNA semispecifically or nonspecifically 1. Semispecific approach Primers recognize a repetitive DNA sequence found at several sites within the genome Therefore, many different DNA fragments will be amplified 2. Nonspecific approach A mixture of primers with many different random sequences is used These will anneal randomly throughout the genome and amplify most of the chromosomal DNA 18-42 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

9 RT-PCR is carried out in the following manner
PCR is also used to detect and quantitate the amount of RNA in living cells The method is called reverse transcriptase PCR (RT-PCR) RT-PCR is carried out in the following manner RNA is isolated from a sample It is mixed with reverse transcriptase and a primer that will anneal to the 3’ end of the RNA of interest This generates a single-stranded cDNA which can be used as template DNA in conventional PCR RT-PCR is extraordinarily sensitive It can detect the expression of small amounts of RNA in a single cell 18-43 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

10 Diagnostyka molekularna w wykrywaniu czynników infekcyjnych i badaniach epidemiologicznych

11 Powszechnie stosowane metody wykrywania i identyfikacji drobnoustrojów opierają się głównie na badaniu cech morfologicznych, serologicznych i biochemicznych.

12 Ostatnie osiągnięcia biologii molekularnej i biotechnologii szybko zmieniają procedury diagnostyczne stosowane w analizie mikrobiologicznej. Bakterie chorobotwórcze, a także wirusy, grzyby i pasożyty, wcześniej izolowane i identyfikowane pracochłonnymi i długotrwałymi metodami klasycznej mikrobiologii mogą dzisiaj być wykrywane przez zastosowanie testów opartych na analizie kwasów nukleinowych. Jedną z najbardziej eksploatowanych metod w tych próbach, opartych na analizie materiału genetycznego, jest technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych.

13 Zasady reakcji PCR Technika łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) pozwala na selektywną amplifikację DNA in vitro przez naśladowanie zjawiska replikacji DNA in vivo. Wymaga następujących czynników reakcji: jednoniciowej matrycy DNA, starterów (sekwencji oligonukleotydów komplementarnych do końców zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA), trójfosforanów deoksynukleozydów (dNTP) i enzymu termostabilnej polimerazy DNA.

14 Reakcja PCR przebiega cyklicznie, a każdy cykl złożony jest z trzech etapów:
denaturacji dupleksu DNA (92-960C), dołączania starterów do miejsca komplementarnego matrycy (30-720C), wydłużania startera od końca 3'-OH przez sukcesywne dosyntetyzowanie dNTP w temperaturze 720C.

15 W większości zastosowań techniki PCR, takie czynniki jak:
odpowiedni wybór, charakter sekwencji i kombinacje stosowanych starterów odgrywają zasadniczą rolę w osiągnięciu pozytywnych rezultatów amplifikacji pożądanego produktu. W zależności od celu, użyteczna długość starterów wynosi od 14 do 40 nt, z zawartością par G+C w zakresie 40-75%.

16 Ogólne zasady projektowania specyficznych starterów w reakcjach diagnostycznych dotyczą:
startery powinny być komplementarne do sekwencji genomu zlokalizowanych wewnątrz regionów wysoce konserwatywnych dla analizowanego rodzaju; 3' końce starterów powinny zawierać kodony niezdegenerowane (np., dla Trp i Met); 3' końce starterów powinny być niekomplementarne w stosunku do siebie (brak możliwości tworzenia dimerów); poszczególne startery nie powinny zawierać sekwencji palindromicznych; nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych; należy unikać w sekwencjach starterów nierównej dystrybucji rejonów bogatych w G/C lub A/T. Większość zastosowań reakcji PCR kontrolowana jest głównie przez odpowiednie projektowanie oraz wybór kombinacji starterów.

17 Zastosowania techniki PCR w diagnostyce molekularnej
Diagnostyka molekularna, oparta o metody analizy materiału genetycznego (w tym na technice PCR), znajduje praktyczne zastosowania w wielu dziedzinach medycyny między innymi takich jak: diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie, diagnostyka chorób infekcyjnych, wczesne wykrywanie nowotworów, diagnostyka sanitarna, diagnostyka w medycynie sądowej, transplantologia.

18 Gwałtowny rozwój biologii molekularnej, w szczególności w ostatnich 20 latach, otworzył nowe możliwości dla diagnostyki mikrobiologicznej. Klasyczne metody identyfikacji i różnicowania drobnoustrojów opierają się głównie na obserwacji cech fenotypowych, czyli na ocenie poziomu ekspresji cech biochemicznych, morfologii kolonii, barwieniu komórek, otoczek, przetrwalników oraz określaniu wrażliwości na antybiotyki i bakteriofagi. Wysoki poziom zmienności fenotypowej wśród populacji bakteryjnej może jednak prowadzić do zafałszowania wyników przeprowadzanych analiz, co w niektórych przypadkach może okazać się katastrofalne w skutkach.

19 Drugą połowę dwudziestego wieku cechuje bardzo dynamiczny rozwój technik biologii molekularnej. W sytuacji, gdy stwierdza się niewystarczalność metod fenotypowych pomocne mogą okazać się techniki typowania mikroorganizmów oparte na analizie materiału genetycznego - metody genotypowe. Materiał genetyczny jest unikalny i stały (niezmienny w porównaniu do cech fenotypowych) dla każdego organizmu. Z tego względu metody genotypowe znajdują coraz szersze zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej (identyfikacji, wykrywaniu, różnicowaniu).

20 Jedną z najbardziej eksploatowanych metod opartych na analizie materiału genetycznego jest technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych. Dzięki technice PCR uległa zwiększeniu czułość i specyficzność badań diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki medycznej techniki PCR uprościło również procedury badawcze umożliwiając ich automatyzację i powstanie szeregu handlowo dostępnych testów. Metody biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, w tym także technika PCR, znalazły także szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów, np. w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych.

21 Metodami analizy DNA można skutecznie rozpoznawać szereg chorób infekcyjnych. Szczególny postęp zanotowano w diagnostyce patogenów wolno rosnących lub trudnych do hodowli. Wszędzie tam gdzie jest to możliwe i opłacalne, diagnostyka klasyczna zostaje zastąpiona lub uzupełniona przez amplifikację charakterystycznego dla patogenu fragmentu DNA w tzw diagnostyce molekularnej.

22 Metody biologii molekularnej, w tym także technika PCR, znalazły szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów np. w badaniach epidemiologicznych.

23 Różnicowanie lub inaczej typowanie mikroorganizmów ma ogromne znaczenie w mikrobiologii medycznej.
Służy ono badaniu ich epidemiologii, czyli m. in. ekologicznych zachowań drobnoustrojów i dróg ich rozprzestrzeniania. Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między mikroorganizmami.

24 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych
Wyniki fałszywie pozytywne Kontaminacja postamplifikacyjnym produktem Kontaminacja reagentów Kontaminacja organizmem podczas przygotowywania kontroli pozytywnej lub próbek dodatnich

25 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych
Wyniki fałszywie nagatywne Inhibitory reakcji Błąd w objętości próbek Błąd wykonawcy Zła izolacja kwasów nukleinowych Zepsucie aparatury (termocykler) Problemy związane z reagentami (stężenie magnezu, synteza primerów)

26 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych
Zbyt duża czułość Przypadkowe pojawienie się patogena, wykrywanie martwych organizmów

27 PROBLEM SZCZEPÓW OPORNYCH NA PRZYKŁADZIE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1940r. wprowadzenie penicyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe; 5 lat później, 50% izolatów opornych na penicylinę (ekspresja b-laktamaz); 1960r. wprowadzenie metycyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe (w tym szczepy oporne na penicylinę); rok później, izolacja szczepów opornych w Europie (MRSA), inny mechanizm oporności – gen mecA kodujący białko PBP2a; 1970r. zakażenia szpitalne MRSA w wielu szpitalach europejskich; lata 80, szczepy MRSA oporne na wszystkie nowe antybiotyki b-laktamowe; 1958r. wprowadzenie vankomycyny do terapii – szczepy MRSA wrażliwe; 1987r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych; 1988r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów enterokoków (VRE).

28 ALARM! Pytanie. Czy geny oporności na vankomycynę mogą być przeniesione z stosunkowo avirulentnych szczepów enterokoków do bardzo virulentnych szczepów Staphylococcus aureus?

29 Odpowiedź pozytywna, świadczą o tym:
1992r. opublikowane eksperymenty transferu oporności na vankomycynę in vitro i in vivo z enterokoków do S. aureus; doniesienia o nieskuteczności każdej terapii antybiotykowej infekcji spowodowanych koagulazo-ujemnymi gronkowcami lub enterokokamii; 1997r. doniesienia o izolacji szczepów S. aureus z umiarkowaną opornością na vankomycynę (MIC, 8 mg/mL) w Japonii i USA; koniec 1997r., informacja, że około 20% izolatów MRSA wykazywało umiarkowaną oporność na vankomycynę (MIC, od 2-9 mg/mL); koniec 1997r., uzyskano laboratoryjny mutant S. aureus z wysoką opornością na vankomycynę (MIC, 100 mg/mL).

30 PRZYKŁAD Wykrywanie Staphylococcus aureus i oznaczanie jego oporności na antybiotyki laktamoweprzy użyciu metody Multiplex PCR Barski, P., Piechowicz, L., Galiński, J and Kur, J.: Rapid assay for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using multiplex PCR. Mol. Cell. Probes 10 (1996)

31 Wykrywanie Staphylococcus aureus i oznaczanie jego oporności na antybiotyki laktamowe
przy użyciu metody Multiplex PCR

32 WNIOSKI Opracowano nową metodę oznaczania oporności na antybiotyki b-laktamowe, którą można polecić jako referencyjną. Metoda ta opiera się na technice PCR i odpowiada na dwa podstawowe pytania formułowane przy stawianiu diagnozy dotyczącej zakażeń gronkowcowych. Pytania te brzmią następująco: 1. Czy czynnikiem zakaźnym jest S. aureus ? 2. Czy czynnik zakaźny jest oporny na antybiotyki -laktamowe ?

33 Opracowana metoda wykazuje szereg przewag względem konwencjonalnych metod oznaczania oporności na metycylinę: 1. Większa czułość (wykrywa się szczepy, których oporność na antybiotyki -laktamowe została potwierdzona tylko reakcją MPCR). 2. Znacznie krótszy czas wykonania testu (ok. 4 godzin). 3. Pewność wyników oparta o racjonalne rozpoznanie genetycznej natury oporności na antybiotyki -laktamowe (układ nuc/mec MPCR unika wszystkich problemów diagnostycznych związanych z fenotypową ekspresją oporności, jest bowiem metodą genotypową).

34 Zastosowanie opracowanej metody może
mieć szersze skutki w lecznictwie (antybiotyki glikopeptydowe są nadużywane w leczeniu zakażeń gronkowcowych w przypadkach błędnej identyfikacji szczepów wrażliwych na metycylinę jako szczepów opornych). Oparte na rzetelnej diagnozie, ograniczenie użycia antybiotyków glikopeptydowych, tylko do przypadków zakażeń faktycznie wywołanych przez szczepy MRSA, może spowolnić rozwój oporności na te antybiotyki, pozostające jedynymi jak dotąd skutecznymi lekami przeciwko gronkowcom opornym na - laktamy.

35 Przykład rozwiązań diagnostycznych identyfikacji czynników etiologicznych chorób rozpowszechnianych drogą płciową Chlamydia trachomatis, jeden z częstszych czynników etiologicznych chorób rozpowszechnianych drogą płciową Oferta diagnostyki Chlamydia trachomatis jednego z amerykańskich laboratoriów diagnostycznych obejmuje: ·        hodowlę in vitro; ·        analizę mikroskopową po znakowaniu fluoryzującym przeciwciałem monoklonalnym (ang. direct fluorescent antibody, DFA); ·        wykrywanie antygenu przy pomocy testów immunoenzymatycznych (ang. enzyme linked immunosorbent assay, ELISA); ·        test hybrydyzacyjny wykrywający rybosomalny RNA; ·        wykrywanie techniką PCR specyficznego plazmidu, obecnego w bakteriach.

36 Ten ostatni test (PCR) jest znacznie bardziej czuły (97 - 100%),
Ten ostatni test (PCR) jest znacznie bardziej czuły ( %), niż hodowla (70- 85%), DFA (85%), ELISA ( %) i hybrydyzacja ( %).    Specyficzność i czułość (ang. positive predictive value, PPV) testów wykorzystujących metodę PCR wynosi ponad 99%, a więc znacznie przewyższa wartość tego parametru dla pozostałych metod. Należy się spodziewać, że w najbliższym czasie wiele czołowych laboratoriów referencyjnych zaadaptuje metody diagnostyki molekularnej, zwłaszcza gdy powstanie możliwość rutynowego badania wielu różnych patogenów jednocześnie.

37 Metody typowania mikroorganizmów oparte o analizę kwasów nukleinowych
Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między mikroorganizmami. Wyniki takich badań mogą być podstawą do wprowadzenia środków zapobiegawczych i działań sanitarnych, mających ograniczyć rozprzestrzenianie się zakażeń szpitalnych i związanej z nimi lekooporności.

38 Metody genotypowe najczęściej stosowane do badań epidemiologicznych to: rybotypowanie, elektroforeza pulsacyjna genomu ciętego rzadko tnącymi enzymami restrykcyjnymi (PFGE), ustalanie sekwencji nukleotydowej specyficznego regionu w genomie, różne odmiany techniki PCR fingerprinting. Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego komórki. Nawet dwaj przedstawiciele tego samego gatunku, i spokrewnieni ze sobą, różnią się od siebie na poziomie materiału genetycznego, tak jak ludzie różnią się układami linii papilarnych popularnie nazywanymi odciskami palców (stąd nazwa tej metody, fingerprinting).

39 Cechy efektywnej metody typowania szczepów:
• Wysoki stopień dyskryminacji • Powtarzalność • Zdolność do typowania wszystkich szczepów • Prosta w użyciu • Szybkość • Mało kosztowna • Wystandaryzowana

40 w typowaniu mikroorganizmów”
„Złoty standard” w typowaniu mikroorganizmów” Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową (RFLP-PFGE) Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Liczba i wielkość otrzymanych fragmentów DNA determinowana jest przez długość sekwencji rozpoznawanej przez określony enzym restrykcyjny oraz charakter trawionego DNA (% zawartości par zasad GC w stosunku do AT).

41 W wyniku trawienia otrzymujemy fragmenty DNA o wielkościach od ok
W wyniku trawienia otrzymujemy fragmenty DNA o wielkościach od ok. 0.5 kpz do 1000 kpz. Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej powoli staje się metodą standardową w epidemiologii szpitalnej.

42

43 WADY Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury i zachowania stałych warunków analizy. Częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż otrzymany obraz elektroforetyczny staje się trudny do interpretacji. Otrzymane wzory restrykcyjne mogą również zostać zafałszowane przez fragmenty pochodzące z plazmidowego DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym.

44 Pozwala na całkowitą dyskryminację szczepów bakteryjnych.
ZALETY Wszystkie szczepy są typowalne. Pozwala na całkowitą dyskryminację szczepów bakteryjnych.

45 Rybotypowanie W związku z funkcją rybosomów w każdym organizmie, a także ich kompleksową naturą, geny kodujące rRNA, ułożone w operon rrn, obecne są we wszystkich organizmach bakteryjnych i są wysoko konserwowane ewolucyjnie. Geny te odpowiedzialne są za syntezę 16S, 23S i 5S rRNA. Ich wysoka konserwacja przejawia się w sekwencji nukleotydowej, a także w strukturze pierwszo- i drugorzędowej. Geny kodujące poszczególne rodzaje rRNA rozdzielone są regionami polimorficznymi, które charakteryzują się wysokim zróżnicowaniem pod względem sekwencji i wielkości.

46 Rybotypowanie – c.d. Te cechy genów rDNA czynią z nich dobry molekularny zegar do studiów nad pokrewieństwem filogenetycznym, nawet odległych od siebie organizmów.

47 METODY OPARTE NA TECHNICE PCR METODY HYBRYDYZACYJNE
Różnicowanie bakterii z zastosowaniem metod rybotypowania można przeprowadzić przy użyciu różnych technik, z wykorzystaniem głównie metod hybrydyzacyjnych lub PCR. Komórka bakterii Izolacja genomowego DNA METODY OPARTE NA TECHNICE PCR METODY HYBRYDYZACYJNE Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi. Elektroforeza i transfer rozdzielonych fragmentów DNA na filtr. Hybrydyzacja z sondą komplementarną do rDNA. RFLP zhybrydyzowanego z sondą rDNA (rrn loci) rrn RFLP

48 METODY OPARTE NA TECHNICE PCR
PCR regionu zmiennego między rrs-rrl rDNA. Elektroforetyczny rozdział produktów PCR. Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV. Polimorfizm długości produktów PCR ITS PCR Amplifikacja określonego fragmentu operonu rrn: regionu zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA, regionu zmiennego wewnątrz genu kodującego 16S RNA, regionu zawierającego geny kodujące 16S i 23S rRNA oraz fragment polimorficzny pomiędzy nimi, - regionu zawierającego geny kodujące tRNA. Trawienie otrzymanych produktów enzymami restrykcyjnymi. Elektroforetyczny rozdział produktów PCR. Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV. RFLP produktów amplifikacji regionów operonu rrn ARDRA PCR regionu zawierającego gen kodujący 16S rRNA Sekwencjonowanie otrzymanych produktów PCR.

49 1.    Nowak, A., Burkiewicz, A. and Kur, J.: PCR differentiation of
seventeen genospecies of Acinetobacter. FEMS Microbiol. Lett. 126 (1995) 2.    Kur, J., Burkiewicz, A., Zabłocka, A. and Gospodarek, E.: Identification of Pseudomonas aeruginosa on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Acta Biochim. Polon. 44 (1995) 3.    Kur, J., Burkiewicz, A., Samet, A. and Sienkiewicz, I.: Identification of Serratia marcescens on the basis of Polymerase Chain Reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Acta Microbiol. Polon. 44 (1995)

50

51 Amplifikacja znanych regionów genomu połączona z analizą restrykcyjną (PCR/RFLP)
Jako cel molekularny w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się fragment DNA specyficzny dla danego gatunku lub kilku gatunków spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym. Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi. W wyniku restrykcyjnego cięcia produktów PCR otrzymuje się specyficzny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP).       Połączenie obu technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie blisko spokrewnionych organizmów lub szczepów. Wybór odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez charakter produktu amplifikacji.

52 Amplifikacja fragmentu genu recA Acinetobacter sp.
M - marker wielkości DNA (501, 489,404, 331, 242, 190, 147, 111 i 110 pz); K - kontrola negatywna reakcji; 1,7, 12,15, 16,17 - produkty PCR otrzymane na matrycach szczepów Acinetobacter sp. Amplifikacja fragmentu genu recA dla sześciu genotypów Acinetobacter. Elektroforogram w 2% żelu agarozowym.

53 Elektroforogram produktów amplifikacji referencyjnych szczepów Acinetobacter trawionych endonukleazą restrykcyjną Tsp5091. M – marker wielkości DNA (501,489,404,331,242,190,147,11 i 110 pz); Numery studzienek odpowiadają produktom PCR otrzymanym dla szczepów referencyjnych Elektroforogram produktów PCR trawionych endonukleazą Tsp5091 klinicznych szczepów Acinetobacter. M – marker wielkości DNA (501,489,404,331,242,190,147,11 i 110 pz)

54 Nowak, A. and Kur, J.: Genomic species typing of acinetobacters by polymerase chain reaction amplification of the recA gene. FEMS Mikrobiol. Lett. 130 (1995) Nowak, A. and Kur, J.: Differentiation of seventeen genospecies of Acinetobacter by multiplex polymerase chain reaction and rstriction fragment length polymorphism analysis. Mol. Cel. Probes 10 (1996) Krawczyk, B., Lewandowski, K., Kur, J.: Comparative studies of the Acinetobacter genus and the species identification method based on the recA sequences. Mol. Cell. Probes 16 (2002) 1-11.

55 PCR fingerprinting • Istnieje wiele różnorodnych metod PCR fingerprinting, ale zasadniczo ich wspólnym celem jest powielenie polimorficznego regionu DNA w reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednio dobranych starterów. • Jedna ż metod PCR fingerprinting wykorzystuje istnienie repetytywnych sekwencji w genomach mikroorganizmów (bakterii, grzybów i pasożytów). Sekwencje te charakteryzują się określoną długością i są szeroko rozpowszechnione w genomie. U bakterii zostały one najwcześniej wykryte i dobrze scharakteryzowane dla Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. Repetitive Chromosomal Elemets) o długości 38 pz i ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości pz, występujące u bakterii Gram ujemnych.

56 Samet, A. , Bronk, M. , Hellmann, A. , Kur, J
Samet, A., Bronk, M., Hellmann, A., Kur, J. (1999) Isolation and epidemic logical study of vancomycin -resistant Enterococcus faecium from patients of a Haematological Unit in Poland. J. Hosp.Intec

57 AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP, łączy w sobie dwie metody:RFLP i selektywną amplifikację PCR. Strategia metody złożona jest z czterech podstawowych etapów: ·       trawienie totalnego DNA komórkowego z zastosowaniem dwóch racjonalnie dobranych enzymów restrykcyjnych; ·       reakcja ligacji otrzymanych fragmentów z odpowiednio zaprojektowanymi adaptorami; ·       selektywna amplifikacja produktów ligacji z zastosowaniem dwóch starterów homologicznych do sekwencji adaptor-miejsce restrykcyjne; · elektroforeza produktów amplifikacji i autoradiografia otrzymanych rozdziałów elektroforetycznych.

58 W odróżnieniu od metod rybotypowania i analizy RFLP produktów PCR, AFLP opiera się na analizie całego genomu bakteryjnego. Zaletami metody AFLP są powtarzalność i wysoki stopień dyskryminacji badanych organizmów. AFLP okazała się niezmiernie przydatnym narzędziem taksonomicznym ze względu na możliwość komputerowej analizy otrzymanych wyników oraz stworzenia na ich podstawie komputerowej bazy danych. Jednakże, AFLP nie jest użyteczna w szybkiej identyfikacji szczepów, ale jest niezmiernie przydatna w studiach dotyczących fundamentalnych pytań odnośnie pokrewieństwa klonalnego szczepów.

59 ...cdn

60

61 ADSRRS fingerprinting (ang
ADSRRS fingerprinting (ang. Amplification of DNA Surrounding Rare Restriction Sites) Masny, A. and Płucienniczak, A. (2001) Fingerprinting of bacterial genomes by amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites. BioTechniques 31,

62 1. Krawczyk, B. , Lewandowski, K. , Bronk, M. , Samet, A. ,. Myjak, P
1.    Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A., Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Meth. 52/3 (2003) 2. Krawczyk, B., Naumiuk, Ł., Lewandowski, K., Baraniak, A., Gniadkowski, M., Samet, A., Kur, J.: Evaluation and comparison of random amplification of polymorphic DNA, pulse field gel electrophoresis and amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites methods for typing Serratia marcescens outbreaks. FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2003).

63

64 C A B M2 K a1 b1 c1 d1 e1 f1 a2 b2 c2 d2 a3 b3 c3 d3 e3 M1 Outbreak 1
- a1 b1 c1 d1 e1 f1 a2 b2 c2 d2 a3 b3 c3 d3 e3 M1 B Outbreak 1 Outbreak 2 Outbreak 3 M K A1 B1 D G1 A2 C2 D A B D3 A M a1 b1 c1 d1 e1 f a b2 c2 d2 a3 b3 c3 d3 e3 C Outbreaak 2

65 Zadaniami na najbliższą przyszłość dla bakteriologii klinicznej wydają się być:
 (1)        wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych i nowych podłóż wybiórczych dla szybkiej identyfikacji bakterii endemicznych (wywołujących zakażenia szpitalne), a także szybkich testów różnicujących z ustaleniem wzorca oporności; (2) stworzenie ośrodków referencyjnych zajmujących się drobnoustrojami mającymi zasadnicze znaczenie w zakażeniach szpitalnych (ustalanie genotypów szczepów endemicznych);

66  (3)        wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych służących do bezpośredniego wykrywania drobnoustrojów z materiałów diagnostycznych w rutynowej praktyce (np., PCR); (4)        badania technikami genetyki molekularnej izolatów w celu identyfikacji szczepów endemicznych występujących w szpitalu (regionie).

67 Dziękuję za uwagę. Józef Kur kur@chem.pg.gda.pl Katedra Mikrobiologii
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12. Fili_P