SEMINARIUM W RAMACH PROJEKTU „Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe do zastosowań w biologii i medycynie - Rozwój i komercjalizacja nowej generacji urządzeń diagnostyki molekularnej opartych o nowe polskie przyrządy półprzewodnikowe Zadanie 19. Opracowanie podstaw budowy sensora przeciwciał na bazie powierzchni GaN i ZnO modyfikowanych peptydami. Agnieszka Kaminska , Sylwester Gawinkowski, Tomasz Rolinski, Jacek Waluk, Robert Hołyst 15 listopad, 2011 Instytut Chemii Fizycznej PAN

Antigen-Antibody interactions epitope Laser excitation antibody Sers platform SERS spectrum – detects specific antibody-antigen binding event *The epitope is small (~6 amino acids or ~6 sugars) or a small part of a larger antigen

Zadania wykonane Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN (1) Opracowanie procedur trawienia GaN ( we współpracy z IWC, Janusz Weyher, Igor Dzięcielewski)- sprawdzenie wpływu takich parametrów jak skład i proporcje roztworów używanych do trawienia, czas trawienia, wpływ właściwości warstw GaN tj. gęstości dyslokacji w celu otrzymania optymalnych podłoży do badań ramanowskich

(a) (b) SEM images of sample 185-4 after (a) photo-etching and (b) additional etching in hot KOH solution (a) (b) SEM images of samples N1516-3.1 and -IV.1 after (a) 5 minutes and (b) 10 minutes photo-etching

400 nm Au SEM images of samples (a) after photo-etching Zadania wykonane Opracowanie aktywnej platformy do badań powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana ( ang. Surface enhanced Raman Spectroscopy, SERS) bazującej na GaN (2) Optymalizacja procedur pokrywania trawionych podłoży GaN warstwami Au i stopem Au-Ag (60%/ 40%) Au 400 nm SEM images of samples (a) after photo-etching and (b) subsequent evaporation of ~ 70 nm of Au. Photo-etching of GaN was done in the K2S2O8-KOH water solution under UV illumination Au-Ag (60%/ 40%)

Zadania wykonane 2. Fabrykacja nowych podlozy do pomiarów SERS bazujących na nanodrutach ZnO pokrytych zlotem. z wykorzystaniem techniki CVD(Chemical Vapour Deposition) na podłożu. 1.Aktywacja podłoża ITO przy zastosowaniu KMnO4 2.Reaktywny wzrost nanostruktur ZnO z roztworu zawierającego Zn(NO3)2 oraz KOH 3. Pokrycie warstwą złota   Rys.1. Widma SEM podlozy do pomiarow SERS otrzymanych technika CVD. Zdjęcia dla próbek otrzymanych w warunkach T=800oC, t=15 min, VNH3=1o dm3*h-1, VN2=140 dm3*h-1. EF=104

Zadania wykonane Opracowanie metody do analizy powtarzalności widm Ramana bazującej na korelacji liniowej Pearsona Tabela1. Wartości współczynników korelacji liniowej między drugimi pochodnymi spektrogramów Rys. Porównanie serii danych przed filtracją (górny panel) i jej drugiej pochodnej uzyskanej za pomocą filtra ( dolny panel).

stężenia roztworu adsorpcyjnego Zadania wykonane Opracowanie procedur kontrolowanej immobilizacji peptydów na platformach sersowskich. Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą kwasu 11-merkaptoundekanowego (-), struktury nieuporządkowane, liczne wiązania wodorowe Immobilizacja aminokwasów na powierzchni sersowskiej pokrytej monowarstwą cysteaminy – „ tworzenie wiązań peptydowych w wyniku reakcji EDC/NHS” - (+) Zbadanie wpływu warunków otrzymywania monowarstw cysteaminy na strukturę otrzymywanych warstw wpływ pH czasu adsorpcji stężenia roztworu adsorpcyjnego elektrolitów

Monowarstwy cysteaminy- podsumowanie Optymalne parametry procesu samoorganizacji prowadzące do monowarstw cysteaminy zbudowanych głównie z konformerów Trans !!! adsorpcja z rozpuszczalników polarnych z roztworów o stężeniu powyżej 15mM czas adsorpcji 1.5h pH od 1.5 do 3

Immobilizacja aminokwasów i peptydów na monowarstwach łącznikowych Zadania wykonane Immobilizacja aminokwasów i peptydów na monowarstwach łącznikowych Optymalizacja warunków prowadzenia reakcji EDC/NHS ( wpływ pH, czasu, stężeń i proporcji reagentów) Immobilizowany peptyd musi mieć odpowiednią orientację i zachowywać swoją aktywność biologiczną 2. Immobilizacja przeciwciał na zmodyfikowanych polipeptydami platformach. Optymalizacja warunków tworzenia kompleksu kompleksu peptyd blokujący-przeciwciało (pI przeciwciała, stosunek ilościowy reagentów, pH buforu z przeciwciałem - pomiędzy pIAg a pIAb, czas)

Immobilizacja aminokwasów Widmo SERS (a) monowarstwy cysteaminy zaadsorbowanej na podlozu GaN pokrytym zlotem; widma SERS widmo SERS monowartwy cysteaminy z przylaczonym kwasem glutaminowym po 10min i ( b; (c) 30 min. i (d) 2 godzinach modyfikacji aminokwasem. Insert przedstawia normalne widmo Ramana kwasu glutaminowego.

Antigen- Blocking peptide interaction blocking peptide (Akt(pan)) + mAb blocking peptide (Akt(pan))

Baza widm Zadania wykonane Rejestracja i opracowanie widm Rama 20 aminokwasów Rejestracja i opracowanie widm SERS aminokwasów Rejestracja i opracowanie widm hetero i homo-peptydów Baza widm

Identyfikacja położenia pików aminokwasów względem pików danego aminokwasu na przykładzie tyrozyny I - intensywności pików tyrozyny E - położenia pików tyrozyny n - liczba pików pozostałych aminokwasów mająca to samo położenie Arg – położenie pików argininy zgodnych z położeniem pików tyrozyny. Liczba oznacza intensywność, zaś puste miejsce – brak piku Pro – Trp – jak wyżej dla odpowiedniego aminokwasu

Identyfikacja aminokwasów w mieszaninie na podstawie spektrogramu Rysunek. Uproszczony spektrogram mieszaniny tyrozyny i asparaginy do badania korelacji ze spektrogramami pojedynczych aminokwasów. Piki czerwone (zielone) są skorelowane z pikami w spektrogramie asparaginy (tyrozyny). Tabela. Ilość par skorelowanych dla poszczególnych aminokwasów. Piki na spektrogramie są sumą mnogościową wszystkich par skorelowanych dla danego aminokwasu.

Zintegrowanie chipu polipeptydowego z układem mikroprzepływowym II. PLANY . Modyfikacja platform sersowskich wybranymi peptydami blokującymi i analiza zmian w widmach ramanowskich indukowanych tworzeniem się kompleksów peptyd blokujacy (epitop) – przeciwciało - kompletowanie bazy widm ramanowskich Zintegrowanie chipu polipeptydowego z układem mikroprzepływowym Testowanie chipu polipeptydowego do wykrywania ważnych immunologicznie przeciwciał jak: IgM, IgA, IgG, albuminy, transferyny, ceruloplazminy z materiałów biologicznych ( surowica krwi, mocz) i kolejno optymalizacja chipu na jedno wybrane przeciwciało Opracowanie platform sersowskich bazujących na ZnO

SERS microfluidic sensor Figure Schematic representation of an integrated SERS-CD platform for biomolecule detection. (a) A SERS spectroscopy and a SERS-CD platform. (reservoirs for activating chemicals (A), cells (B), media (C), and vent (D)) (b) Cell trapping schematics comparing cells before trapping (left) after trapping (right). (C) Sample concentrating cycle: secreted molecules are delivered (left), absorbed (center) and then accumulated on a SERS probe (right), which results in molecule concentrating.