Zjawisko RNAi, mechanizmy epigenetyczne

siRNA i RNAi Zjawisko RNAi zachodzi dzięki małym interferującym RNA (siRNA). siRNA powstają z długich dwuniciowych RNA (dsRNA) pochodzenia egzgennego lub endogennego. Długie dsRNA są przecinane przez RNAazę III o nazwie Dicer, której homologi stwierdzono u wszystkich eukariontów. Oznacza to, że regulacja za pośrednictwem małych RNA jest b. stara ewolucyjnie i może mieć kluczowe znaczenie biologiczne. siRNA generowane przez Dicer to dwuniciowe cząsteczki ok. 22 nt, z 2 nt jednoniciowymi fragmentami na 3’ końcach. Każdy łańcuch ma na 5’ końcu fosforan a na 3’ końcu -grupę OH. siRNA łączy się z kompleksem nukleazowym zwanym RISC (RNA-induced silencing complex), który ulega aktywacji poprzez katalizowaną przez helikazę RNA utratę jednego z łańcuchów dupleksu siRNA. Zaktywowany RISC odnajduje a następnie przecina mRNA komplementarny do siRNA.

Model RNAi

Składniki kompleksu RISC Kompleksy RISC zawierają konserwowane ewolucyjnie silnie zasadowe białko (ok. 100 kDa) z rodziny Argonaute (AGO)

Źródła siRNA Naturalnie występujące siRNA powstają z transpozonów, wirusów, które wytwarzają dsRNA podczas replikacji i innych rodzajów dwukierunkowo transkrybowanych, powtarzających się sekwencji

U niektórych organizmów (nicienie, grzyby) siRNA mogą być amplifikowane z udziałem RNA zależnej RNA polimerazy (RdRp)

U Drosophila i ssaków RNAi indukowane przez dsRNA zanika zwykle po kilku podziałach, organizmy te nie mają RdRp.

miRNA (microRNA) U ssaków, C. elegans, Drosophila i roślin wykryto setki małych RNA, które nazwano miRNA (microRNA), nieodróżnialnych pod względem właściwości biochemicznych od aktywnych siRNA (ok.22 nt, 5’P, 3’OH). Wspólną cechą tych miRNA (odróżniającą je od klasycznych siRNA) jest to, że sekwencje ich odnajdywane są w trzonkach charakterystycznej struktury „stem-loop”, zwykle ok. 70 nt typu niedoskonałych szpilek do włosów, z wybrzuszeniami i wewnętrznymi pętlami. miRNA powstają z długich pierwotnych transkryptów (pri-miRNA), które są następnie w jądrze przycinane do charakterystycznych szpilek do włosów o długości ok. 70 nt. Te ostatnie są eksportowane do cytoplazmy, gdzie Dicer wytwarza z nich miRNA.

Wytwarzanie siRNA i miRNA

RNAi (RNA interference) cechą charakterystyczną wszystkich odmian RNAi są małe 21-24nt RNA RNAi powstało najprawdopodobniej jako mechanizm obrony przeciw wirusom, występuje u wszystkich badanych eukariontów RNAi został wykorzystany przez komórki do utrzymywania heterochromatyny na cetromerach i obszarach zawierających wielokrotne powtórzenia odmianą RNAi używaną przez wszystkie znane eukarionty wielokomórkowe jest RNAi z udziałem miRNA sRNA first discovered in A. thaliana

model RNAi miRNA siRNA PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) TGS prekursor dsRNA 21-24 nt małe RNA miRNA siRNA RISC (RNA induced Silencing Complex) RITS (RNA induced Transcriptional Silencing) tworzenie heterochromatyny: metylacja DNA, metylacja histonu H3 K9 cięcie mRNA lub inhibicja translacji

model RNAi PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) TGS prekursor dsRNA 21-24 nt małe RNA RISC (RNA induced Silencing Complex) RITS (RNA induced Transcriptional Silencing) regulacja ekspresji genów (30% ludzkich genów) Integralność centromerów, kontrolowanie transpozonów, regulacja ekspresji genów?

Rola miRNA Wyciszanie genów za pośrednictwem miRNA jest niezbędne w przebiegu rozwoju roślin i zwierząt

Mechanizmy epigenetyczne

Znaczenie biologiczne i definicja operacyjna pamięci komórkowej W organizmach wielokomórkowych niezbędne jest zachowanie „tożsamości komórek”, stanu ustalanego w trakcie rozwoju. „Tożsamość komórek” sprowadza się do charakterystycznego profilu ekspresji genów. Pamięć komórkowa jest mechanizmem epigenetycznym umożliwiający ustalenie i dziedziczenie „tożsamości komórek” (określonego profilu ekspresji genów).

Dziedziczenie epigenetyczne:definicja i mechanizmy D.E.: dziedziczne modyfikacje funkcji genów nie związane ze zmianami w sekwencji DNA Podstawowe mechanizmy epigenetyczne: Modyfikacje chromatyny Metylacja DNA: CpG, CpNpG, CpNpNp (asymetryczna)

Chromatyna – substrat modyfikacji epigenetycznych

Acetylacja lizyny

Modyfikacje histonów ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPH DFKTD SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR KRKTV Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Methylation

Modyfikacje histonów SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV PKKTE H2A SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV PKKTE H2B PEPSKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRK VTKYT Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Methylation Lysine Ubiquitination

Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie H2A H2A H2B H2B

Po-translacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie wg. B Po-translacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie wg. B.Turner, Cell 2002

Organizacja DNA w jądrze

Determinanty aktywnej i wyciszonej chromatyny

Przykład przeciwstawnych funkcji modyfikacji histonów H3/H4 AcLys/H3metLys4(H3K4) - związane z rejonami aktywnej transkrypcji H3/H4 Lys+/H3metLys9 (H3K9) - związane z rejonami wygaszonej transkrypcji.

Metylacja DNA zamienia cytozyne w 5-metylo cytozynę

Metylacja DNA u eukariontów Nie jest uniwersalna; występuje u ssaków i roślin kwiatowych. Zmienność gatunkowa, tkankowa i w odniesieniu do lokalizacji na chromosomach. Rozpoznawana przez rodzinę białek zawierających domenę wiążącą się do metylo-CpG (methyl-CpG binding domain -MBD). Zciąga kompleksy białkowe indukujące lokalne zmiany w strukturze chromosomów. Wyłącza ekspresję genów.

Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA) Lcyc kontroluje symetrię grzbietowo-brzuszną kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161

PRZEBUDOWA CHROMATYNY ZALEŻNA OD ATP Kingston, R.E., Narlikar, G.J. Genes&Development 13:2339-2352(1999)

Kompleksy typu SWI/SNF Saccharomyces cerevisie Drosophila melanogaster Kompleksy typu ISWI Kompleksy typu Mi2 Saccharomyces cerevisie PHD bromo- SANT fingers ATP-ase ATP-ase ATP-ase chromo- Homo sapiens Drosophila melanogaster Ryc.1. Systematyka ATP-zależnych kompleksów remodelujących chromatynę (wg Geeta, 2002).

Enzymy modyfikujące histony i DNA a koncepcja procesywności HAT – acetylotransferazy histonów (bromodomena) HDAC – deacteylazy histonów HMT – metylotransferazy histonów (chromodomena). CMT3 – DNA metylotransferaza (chromodomena)

Kompleksy remodelujące chromatynę – procesywność SWI/SNF type ISWI type Mi2 type Mi2 Swp73 swi3 snf5 swi2 ISWI ATPase Bromodomain ATPase SANT/SLIDE ATPase Chromodomain

Przebudowa chromatyny a metylacja DNA

Kluczowa funkcja białka DDM1- ‘Decrease in DNA Methylation 1’ ddm1 – 70% spadek poziomu metylacji DNA (Arabidopsis) = deregulacja ekspresji genów i aktywacja milczących transpozonów (lsh u myszy – podobnie). ddm1 – zmiany w rozkładzie H3K9 w chromosomach. DDM1 nie jest DNA-metylotransferazą.

Filogeneza nadrodziny SWI2/SNF2

41 SNF2 proteins in plants: genes control and beyond Kniżewski, Ginalski & Jerzmanowski, Trends in Plant Science, 2008

rDDM1 jest ATPazą aktywowaną przez DNA i chromatynę

Aktywność DDM1 w stosunku do nukleosomu Pozycja skrajna Pozycja centralna

Właściwości i funkcja DDM1 DDM1 jest czynnikiem remodelującym chromatynę (z udziałem ATP). DDM1 samodzielnie nie rozpoznaje metylacji DNA. DDM1 jest kluczowym czynnikiem łączącym remodeling chromatyny i wprowadzanie/utrzymywanie metylacji DNA

Architektura chromatyny w jądrze

Znaczniki epigenetyczne związane ze stanami chromatyny ATP-dependent chromatin remodeling ATP- dependent chromatin remodeling ATP-dependent chromatin remodeling