Biologia molekularna roślin 2008/2009

Program Podstawowe koncepcje i metodologia biologii molekularnej roślin. Rośliny modelowe. Genetyka klasyczna (forward genetics) i odwrotna genetyka (reverse genetics) w analizie funkcji genów u roślin – analiza na przykładach. Genomika roślin: kompletne sekwencja, struktura i ewolucja genomów roślinnych. Współczesne metody po-genomiczne: transkryptomika (mikromacierze DNA), proteomika (analiza białek za pomocą spektrometrii mas), inne –omiki. Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja: zjawisko RNAi (interferencja RNA), chromatyna i dziedziczenie epigenetyczne. Organizacja i regulacja ekspresji genów organellarnych. Stres, fitohormony i transdukcja sygnałów u roślin. Genetyczna regulacja rozwoju embrionalnego i procesu kwitnienia. Współczesna biotechnologia roślin a etyka.

Podstawowe koncepcje i metodologia biologii molekularnej roślin Wykład 1 Podstawowe koncepcje i metodologia biologii molekularnej roślin

Cykl życia

Centralny dogmat biologii molekularnej- idea DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja Organizm

Centralny dogmat-realizacja W organizmach informacja przepływa od DNA (kwasów nukleinowych) do białek, nigdy odwrotnie.

Centralny Dogmat (CD) w komórce CD stwierdza, że informacja zawarta w genach (DNA) przyjmuje ostatecznie fizyczną postać fenotypu (białka). Organelle roślinne są zarówno pochodzenia eukarotycznego (jądro), jak i prokariotycznego (chloroplasty, mitochondria). Chloroplasty i mitochondria, podobnie jak DNA, zawierają DNA. Zasada CD jest realizowana we wszystkich organellach. Odwrotna transkrypcja nie występuje w chloroplastach i w mitochondriach. W mitochondriach roślinnych występuje edytowanie mRNA.

Elementy budowy DNA Składniki DNA: deoksyryboza (oznaczenie atomów C: 1’-5’); fosforan (uczestniczy w wiązaniu: deoksy-5’-P-3’-deoksy); zasada azotowa: A,T,G,C – dołączona do C-1’ deoksyrybozy.

Schemat budowy nici DNA 5' 3’ Łańcuch utrzymywany przez wiązania 3’-5’ fosfodiestrowe tworzy szkielet cząsteczki

Polarność nici DNA Na jednym końcu nici DNA występuje wolna grupa C3’-OH (3’ koniec) a na drugim – C5’-OH (5’ koniec).

Zasada budowy DNA DNA jest dwuniciowy; ten typ budowy cząsteczki umożliwia zjawisko komplementacji. W dwuniciowym DNA naprzeciwległe (antyrównoległe) nici mają przeciwną polarność (3’-5’ vs. 5’-3’). Cząsteczka jest stabilizowana przez wiązania wodorowe miedzy zasadami i wiązania hydrofobowe pomiędzy równolegle nad sobą ułożonymi płaszczyznami zasad (stacking).

A-T

G-C

DNA: struktura formy B

DNA: widok z góry

Geometria DNA w formie B 1.9 nm

Przyczyna różnic w wielkości rowków w DNA

Rowki i ‘stacking’ (ułożenie warstwowe) zasad w DNA

Ułożenie w sąsiadujących parach zasad

Różne formy DNA

Formy DNA - parametry DNA opisany przez W-C – w formie B. Obecnie wiadomo, że DNA może występować także w innych formach. Główna różnica między formami: kierunek skręcenia helisy A, B, C – helisa prawoskrętna Z – helisa lewoskrętna (występuje in vitro w wysokim stężeniu soli) W komórce – głównie forma B. Forma Z może istnieć w warunkach niskiego stężenia soli (w komórce), gdy w DNA występują naprzemienne ciągi puryn i pirymidyn, np. poli-GC lub poli- AT, lub 5-metylo-cytozyna. A 11.0 zasad/skręt śr. 23A B 10.0 zasad/skręt, śr. 19A C 9,3 zasad/skręt, śr 19A Z 12.0 zasad/skręt, śr. 18A

DNA w formie B i DNA w formie Z

Replikacja DNA Reakcja: dATP, dCTP, dGTP, dTTP -> Polimer DNA + PPi (PPi + H20 -> hydroliza pirofosforanu napędza reakcję) Wymagane: Enzym – polimeraza DNA, matryca DNA, Mg++, primer

Synteza DNA Mechanizm: 3’-OH cząsteczki cukru atakuje 5’ fosforan w trifosfodeoksynuklozydzie. Każdy kolejny nukleotyd dodawany jest do 3’ końca kwasu nukleinowego. Reakcja związana jest z ukierunkowaną 5’->3’ aktywnością polimerazy DNA

Kierunek syntezy nici DNA Nić DNA rośnie zawsze w kierunku 5’ -> 3’.

Enzymologia replikacji DNA - I Większość danych o syntezie DNA z badania bakterii. U bakterii dwie ważne polimerazy DNA: I i III. DNA polimerazy wymagają „primera” w postaci fragmentu nici polinukleotydowej, nie potrafią tworzyć nici od „zera”. W celu rozpoczęcia nici od „zera” polimeraza RNA (primaza) sytntetyzuje primer RNA (RNA polimeraza sama nie wymaga primera). W wypadku wydłużania nici DNA, istniejąca nić służy jako primer. DNA polimerazy I i III mają aktywność 3’->5’ egzonukleazy (tj.w kierunku przeciwnym do kierunku polimeryzacji) zdolną do niszczenia nowo zsyntetyzowanej nici (tzw. ‘proofreading’) w celu naprawy błędnie włączonych nukleotydów. Problemy w trakcie replikacji: gdzie zacząć (origin), rozwinięcie helisy i stabilizacja rozwinięcia (rep protein, helikaza II), wytworzenie primera, synteza DNA, uwolnienie nowych łańcuchów, topologia.

Enzymologia replikacji DNA - II Nić prowadząca – początek syntezy DNA, synteza bez problemów 5’->3’. U eukariontów: DNA polimeraza δ (delta) Nić opóźniona – primaza wiąże się do sekwencji na nici opóźnionej, odsłoniętym przez białko rep, i syntetyzuje fragment RNA – primer dla nowej cząsteczki polimerazy DNA (u eukariontów Polimeraza ε (epsilon). Primaza przesuwa się wzdłuż nici opóźnionej i powtórnie zaczyna syntezę RNA. W rezultacie, nić składa się z serii krótkich fragmentów DNA, każdy z primerem RNA na 5’ końcu. Są to tzw. ‘fragmenty Okazaki’.

Replikacja nici prowadzącej i nici opóźnionej przebiega niejednakowo. Replikacja DNA Replikacja nici prowadzącej i nici opóźnionej przebiega niejednakowo. delta epsilon AT-bogata sekwencja ‘origin’

Telomeraza: replikacja końców cząsteczek DNA Problem: na końcu nici opóźnionej nie ma miejsca na syntezę primera RNA Rozwiązanie: wydłużyć nić opóźniną

Efekt telomerazy

Mechanizm działania telomerazy

Informacja w DNA

Mutacje są utrwalane w trakcie replikacji Replikacja i mutacje Mutacje są utrwalane w trakcie replikacji

Chromosomy

Chromosomy Arabidopsis thaliana - wygląd w komórce

Chromosomy Arabidopsis thaliana schemat organizacji

Hierarchiczna organizacja chromosomów

Schemat nukleosomu

Chromatyna – względne upakowanie DNA

Zasada sekwencjonowania

Wydruk z sekwenatora

Reakcja PCR

PCR i sekwencjonowanie

Geny w chromosomach

Sekwencjonowanie chromosomu

Mapa genowa fragmentu chromosomu Arabidopsis

Transkrypcja i translacja

Rodzaje RNA - I tRNA – [Przenośnikowy, transportujący], mały (65-110 nukleotydów), przenosi aktywowane aminokwasy do rybosomu, długożyjący (stabilny). rRNA – [Rybosomowy], tworzy (wraz z białkami) rybosomy. Jeden z rRNA jest katalizatorem tworzenia wiązania peptydowego (rybozymem). Różne rodzaje i wielkość (4700 – 120 zasad). rRNA eukariontów i prokariontów zasadniczo się różnią. Długożyjący (stabilny) mRNA –[Matrycowy, Informacyjny], nośnik przepisanej z DNA informacji o sekwencji aminokwasów w białku. Ma cechy umożliwiające przyłączanie się do rybosomów i udział w syntezie białka. Wielkość zależna od wielkości kodowanego polipeptytdu. Zróżnicowana trwałość, raczej mało stabilny.

Rodzaje RNA - II Niekodujace RNA (ncRNA) – nie zaangażowane bezpośrednio w syntezę białka. Biorą udział w wielu innych procesach komórkowych, jak: regulacja transkrypcji, replikacji DNA, obróbki i modyfikacji innych cząsteczek RNA (transkryptów). Długość od 21 do > 10 000 nukleotydów, w zależności od rodzaju i funkcji Przykłady: XIST RNA – inaktywuje jeden z dwóch chromosomów X u samic; snRNA – obróbka dużych prekursorów RNA w jądrze; snoRNA – udział w tworzeniu rybosomów i telomerów; miRNA – udział w regulacji ekspresji mRNA; siRNA – małe RNA, wiążą się do komplementarnych sekwencji RNA znacząc je w ten sposób dla systemu niszczącego (endonukleazy RNA).

tRNA-Phe z drożdży

Rybosom – struktura krystaliczna (na zielono – miejsce katalityczne w rRNA)

Rybosom prokariotyczny

Rybosom eukariotyczny

Rybosomy u pro- i eukariontów

Cechy mRNA Różnią się u pro- i eukariontów. Zawierają rejony nie kodujące białka (5’- i 3’ UTR – untranslated regions). Zawierają sygnał startu translacji, zwykle kodon AUG. Nazewnictwo sekwencji: ‘upstream-’, ‘downstream-’ względem AUG, ponieważ synteza białka biegnie w kierunku 5’->3’. Prokariotyczny mRNA ma ‘upstream’ bogatą w puryny sekwencje konsensusową Shine-Delgano (SD), umożliwiającą przyłączenie do rybosomu (parowanie z 16S rRNA). Eukariotyczny mRNA ma specjalne sekwencje na każdym z końców. 5’ UTR zawiera 5’CAP złożony z m7Gppp->5’O – za nim niekiedy jeden, dwa nukleotydy z grupą metylową na rybozie. Dalej 5’UTR (30-kilkaset nukleotydów), często ze strukturą II-rzędową. 3’UTR (50-300 nukleotydów), struktura II-rzędowa, za nim ogon poliA (20-200 nukleotydów).

Budowa mRNA

Powstawanie mRNA u eukariontów via splicing

RNA w transkrypcji i translacji

Polimerazy RNA u Eukariota Polimeraza Produkt Lokalizacja promotora RNA Pol I rRNA przed startem RNA Pol II mRNA przed startem RNA Pol III tRNA, 5S RNA za startem

Struktura przestrzenna polimeraz RNA: eukariotycznej (RNA Pol-II) i prokariotycznej

Inicjacja transkrypcji u Eukaryota Dwie klasy sekwencji cis-regulatorowych: promotory i enhancery. Promotory – zbudowane modułowo z tzw. elementów promotorowych, tj. krótkich konserwowanych sekwencji DNA występujących w różnych kombinacjach, w odległości około 200 pz od miejsca startu transkrypcji.. Elementy promotorowe są rozpoznawane przez dodatnie regulatory działające w trans, zwane CZYNNIKAMI TRANSKRYPCYJNYMI (TF). Każdy TF musi mieć dwie domeny: DNA-Binding Domain (DBD) wiążącą się do specyficznej sekwencji i Activating Domain (AD), rozpoznająca specyficznie białko. Enhancery – zbudowane modułowo, podobnie jak promotory Rozpoznawane przez dodatnie regulatory typu TF, działające w trans Mogą być zlokalizowane tysiące pz przed lub za miejscem startu transkrypcji, a także wewnątrz genu.

Inicjacja Pol II Wszystkie kompleksy pre-inicjacyjne zawierają TBP (TATA-Binding protein) TBP oddziałuje z Pol II i umożliwia jej przyłączenie się do DNA Konserwowane sekwencje w promotorach pol II: TATA Box (ATATAAA); CAAT Box (GGCCAATCT); GC Box (GGGCGG); Oktamer (ATTTGCAT) Żadna z konserwowanych sekwencji nie jest niezbędna

Podstawowy aparat transkrypcyjny (basal transcription elements)

Elementy regulacji transkrypcji u Eukariota

Funkcja enhancerów w regulacji transkrypcji

Palce cynkowe - element struktury białka rozpoznający sekwencje DNA, występuje w wielu czynnikach transkrypcyjnych (TF)

Palce cynkowe – oddziaływanie z DNA

Czynnik transkrypcyjny z motywem H-T-H (helix-turn-helix)

Budowa suwaka leucynowego

Suwak leucynowy (Leucine zipper)

Elementy warunkujące dostępność DNA dla czynników transkrypcyjnych