ODPOWIEDZI KOMÓRKOWE I ICH DIAGNOSTYKA.

Prezentacja na temat: "ODPOWIEDZI KOMÓRKOWE I ICH DIAGNOSTYKA."— Zapis prezentacji:

1 ODPOWIEDZI KOMÓRKOWE I ICH DIAGNOSTYKA

2 Antygeny komórkowe

3

4 Normy podstawowych subpopulacji limfocytów w krwi obwodowej osób dorosłych
Średnio Zakres LEUKOCYTY (WBC) x103/mm3 5,9 4,6-7,1 Limfocyty (%) 32 28-39 Limfocyty T CD3+ 72 67-76 Limfocyty B CD19+ 13 11-16 Komórki NK 14 10-19 Limfocyty T CD4+ 42 38-46 Limfocyty T CD8+ 35 31-40 CD4/CD8 1,2 1,0-1,5

5 Antygeny różnicowania leukocytów
CD Reactivity CD 45 LCA TdT terminal transferase, progenitors of T and B lymphocytes CD10, CALLA acute B-cell leukaemias CD34 Progenitor cells, acute lymphoblastic and myeloblasic leukaemias CD5 T cells CD19 B lymphocytes CD20 CD21 CD22 CD23 Differentiation of B-cell neoplasms CD7 Limfocyty T CD103 HCL CD56 NK cells CD57 CD13 Myelo-monocytic markers CD15 CD33 CD11c CD14 CD25, 71,69 Ki-67 Markers of proliferating cells

6 Bezpośrednia reakcja immunofluorescencyjna
PE T CD3 FITC

7 Zasada cytometrii przepływowej
Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid

8 FSC – forward scetter (cell size)

9 Side scatter – cell granularity

10 Fluorescence detection

11 Normalny obraz krwi obwodowej

12 B-CLL

13 Badania czynnościowe limfocytów in vivo Testy skórne
Śródskórne podanie antygenu jest stosowane do badania czynnościowej wydolności limfocytów Reakcja na ś. podanie tuberkuliny Pozytywna reakcja pojawia się h jako rumień i stwardnienie Jest charakterystyczna dla uczulonych T limfocytów gromadzących się w miejscu podania antygenu Umiakowana odpowiedź (rumień o śr. 5-6 mm) – osoby , które miały kontakt z prątkami, ale nie zachorowały Silna reakcja (15-20 mm) sugeruje aktywną infekcję Brak reakcji – brak kontaktu z prątkami lub anergia Podnaskórkowe podanie antygenu (alergenu) Badania nadwrażliwości (uczulenia) na określone antygeny Lokalna skórna reakcja zapalna świadczy o wrażliwości na dany alergen

14 Cpm w hodowli stymulowanej
Cpm w hodowli niestymulowanej

15 cpmT - cpmS % cytotoksyczności = cpmM - cpmS
cpmT – średnia arytmetyczna z liczby rozpadów na jednostkę czasu w próbie badanej cpmS – w próbie z uwalnianiem spontanicznym cpmM – w próbie z uwalnianiem maksymalnym

16 Mechanizmy zabijania drobnoustrojów przez komórki żerne
Tlenowe: H2O2, rodniki hydroksylowe, tlen singletowy, kwas podchlorawy, chloraminy Pozatlenowe: BPI (cz. b-bójczy zwiększaający przepuszczalność), defensyny, lizozym

17

18

19 PHAGOTEST Diagnostyczny test do badania zdolności do fagocytozy granulocytów i monocytów w pełnej, heparynizowanej krwi. Test zawiera znakowane fluoresceiną opsonizowane (Ig, C) bakterie (E. coli-FITC) i niezbędne odczynniki Przy pomocy testu ocenia się odsetek granulocytów i monocytów wykazujących zdolność do fagocytozy na podstawie liczby bakterii sfagocytowanych przez komórkę. Ocena wyników: cytometria lub m. fluorescencyjny

20

21 The test kit contains: 1. 1 bottle (2 ml) of stabilized and opsonized FITC-labelled E.coli suspension (E.COLI FITC OPSONIZED), 1 x solution, ready to use, 1 x 109 bacteria per ml. 2. 1 bottle (10 ml) of QUENCHING SOLUTION for suppressing fluorescence of the bacteria attached to the outside of the cell, blue reagent solution, 1 x solution. 3. 1 bottle (20 ml) of DNA STAINING SOLUTION for cytometric discrimination of bacteria during leukocyte analysis, pink reagent solution, 1 x solution. 4. 1 bottle (20 ml) of LYSING SOLUTION (10 x stock solution for storage), provides 200 ml of 1 x solution after 1 : 10 dilution with double distilled water for lysing erythrocytes and simultaneous fixing of leukocytes. 5. 1 bottle of Instamed-Salts as a WASHING SOLUTION (SALTS f. WASHING SOLUTION) to be reconstituted in 1000 ml aqua bidest, provides 1000 ml ready-to-use WASHING SOLUTION.

22

23

24 BURSTTEST (PHAGOBURST™)
Allows the quantitative determination of leukocyte oxidative burst in heparinized whole blood. It contains unlabeled: opsonized bacteria (E.coli), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and the chemotactic peptide N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) as stimulants, Dihydrorhodamine (DHR) 123 as a fluorogenic substrate necessary reagents. It determines the percentage of phagocytic cells which produce reactive oxidants (conversion of DHR 123 to R 123) The evaluation of these bioactivities should be performed by flow cytometry.

25 Heparinized whole blood is incubated with the various stimuli at 37°C, a sample without stimulus serves as negative background control. Upon stimulation, granulocytes and monocytes produce reactive oxygen metabolites (superoxide anion, hydrogen peroxide, hypochlorous acid) which destroy bacteria inside the phagosome. Formation of the reactive oxidants during the oxidative burst can be monitored by the addition and oxidation of DHR 123. The reaction is stopped by addition of LYSING SOLUTION, which removes erythrocytes and results in a partial fixation of leukocytes. After one washing step with WASHING SOLUTION, DNA STAINING SOLUTION is added to exclude aggregation artifacts of bacteria or cells. The percentage of cells having produced reactive oxygen radicals are then analyzed as well as their mean fluorescence intensity

26 aktywacja oksydacja Liza i utrwalanie płukanie

27

28 Test chemiluminescencyjny
Po pochłonięciu mikroorganizmów, komórki fagocytujące emitują niewielkie ilości promieniowania elektromagnetycznego, którego wielkość można zmierzyć przy pomocy odpowiednich mierników. Źródłem tej energii jest reaktywny i bardzo niestabilny tlen singletowy.