OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA

Prezentacja na temat: "OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA"— Zapis prezentacji:

1 OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA
CHIPY BIAŁKOWE OD POMYSŁU DO ZASTOSOWANIA Na podstawie pracy: ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee i Milan Mrksich Jakub Gruszczyk Anna Piłat

2 Co to są chipy ? Inaczej mikromacierze, czujniki, znaczniki
Mogą być zarówno DNA jak i białkowe Wyniki badań przeprowadzone przy ich użyciu można przedstawić wzorami złożonymi z różnobarwnych kropek Po raz pierwszy zostały wprowadzone na rynek w 1996 (mikromacierze DNA) Pozwalają na szybką, łatwą i równoczesną analizę tysiąca elementów w pojedynczym eksperymencie Są stosowane do analizy oddziaływań (antygen-przeciwciało, białko-białko, białko-kw.nukleinowy, białko-lipid, enzym-substrat)

3

4 Przykłady zastosowań chipów białkowych
Niesłychanie przydatne w badaniu biologii komórki, mechanizmy badania nowotworów a także odkrycie molekularnych przyczyn wielu złożonych chorób, szybka diagnoza chorób i prognozowanie ich przebiegu, testowanie leków, podstawowe narzędzia do stworzenia nowych lekarstw, możliwość dostosowania terapii do indywidualnych potrzeb pacjenta, określanie typów białek oraz mierzenia ich ilości w tkankach.

5

6 Immobilizacja białek Reakcja grupy aminowej lizyny z zmodyfikowaną grupą aldehydową (znalazły zastosowanie w charakterystyce oddziaływań białko-białko a także badaniach produktów pośrednich powstałych w wyniku fosforylacji przez odpowiednie kinazy), inny przykład zastosowania: do indentyfikacji nowych klas kalmodulin i fosfolipidów wiążących białka, białka znakowane His-tag (łatwiejsze oczyszczanie).

7 Białkowe chipy używane do analizy aktywności białek drożdży
Kilka tysięcy białek fuzyjnych z GST unieruchomionych na płytce Związanie przeciwciał anty-GST Identyfikacja białek wiążących kalmodulinę i fosfatydyloinozytole

8 Konstrukcja macierzy przeciwciał
Immobilizacja bibliotek fagowych prezentujących fragment scFv przeciwciała na papierowym filtrze w celu selekcji przeciwciał względem specyficznych antygenów, stworzenie molekularnie zdefiniowanych macierzy, badanie reakcji przeciwciała z pokrewnymi antygenami, zastosowanie w medycynie macierzy przeciwciał rozpoznających 75 różnych cytokin; detekcja ilości femtomolowych.

9 Problemy związane z białkowymi chipami
Niektóre interakcje zdefiniowane innymi metodami nie zostały potwierdzone. Przyczyną mogą być : brak jednolitości w aktywności immobilizowanych białek, immobilizacja białek w różnej konformacji, częściowa denaturacja białek na powierzchni, niespecyficzna adsorpcja białek do chipów (blokowanie na powierzchni z BSA, niekontrolowana adsorpcja białek z roztworu).

10                 

11 Zastosowanie do immobilizacji dobrze zdefiniowanych powierzchni
Oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami zależy od wpływu otoczenia, nieznaczne zmiany w środowisku mają wpływ na zachowanie aktywności, istnieje zatem konieczność ujednolicenia warunków, w jakich znajdują się poszczególne immobilizowane cząsteczki.

12 Rozwinięcie strategii immobilizacji
Kontrola przywarcia, gęstość ligandu, wiązanie białka do substratu (ocena aktywności immobilizowanych białek-region aktywny może być związany z sąsiednim białkiem lub powierzchnią macierzy i poprzez to może być zahamowana jego aktywność), His-tag może wiązać się do szklanej powierzchni prezentującej odpowiednią grupę chelatową.

13 Użycie biernych chemicznie i fizycznie powierzchni
Powierzchnia bierna zapobiega zarówno niespecyficznej adsorpcji jak i denaturacji immbilizowanych białek, idealne podłoże do przygotowania chipów białkowych, wypierają one stopniowo stosowane dotychczas metody polegające na: blokowaniu powierzchni przy pomocy BSA, co może prowadzić do niespecyficznych oddziaływań, przeprowadzaniu eksperymentu w obecności detergentu, co może przeszkadzać w oddziaływaniach.

14 DETEKCJA Użyteczność każdego rodzaju mikromacierzy zależy od tego, jaka technika zostanie zastosowana do jej analizy. Zazwyczaj stosuje się detekcję opartą na fluorescencji lub zastosowaniu sond radioaktywnych w celu określenia związania się białek lub przeciwciał do macierzy.

15 DETEKCJA Sposoby detekcji ilości wiążącego się białka:
Znakowanie białka sondą a następnie inkubacja na macierzy ; po odmyciu macierz jest analizowana w celu wykrycia obecności znakowanego białka i określenia typu związanego partnera, w celu identyfikacji określonej aktywności enzymatycznej, np. oznaczenie aktywności kinazowej polega na zastosowaniu przeciwciał przeciwko fosfotyrozynie, co pozwala na identyfikację substratów tych enzymów.

16 PORÓWNANIE METOD DETEKCJI
analiza ilościowa real-time nieznakowane białka i złożone próbki nowe aktywności dostępność fluorescencja + - WYSOKA izotopy promieniotwórcze MALDI-TOF CZĘŚCIOWA POŚREDNIA SPR OGRANICZONA

17 DETEKCJA Chociaż zastosowanie znaczników
fluorescencyjnych i radioaktywnych odznacza się wysoką czułością i rozdzielczością posiada jednak pewne ograniczenia: modyfikacja białka przy pomocy sondy ma wpływ na jego aktywność, koszt i utylizacja szczególnie w przypadku radioizotopów, ograniczenie do badania tylko tych oddziaływań, dla których cząsteczki zostały wyznakowane, a nie pozwala na odkrywanie nowych właściwości.

18 DETEKCJA Przykład dwóch technik nie wymagających
znakowania białek i pozwalających na analizę skomplikowanych próbek o złożonym i często niezdefiniowanym składzie: SPR MALDI-TOF

19 MALDI-TOF MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (źródło jonów) Time Of Flight (analizator) jest jedną z technik spektrometrii masowej, wykorzystuje ona impuls laserowy w celu jonizacji próbki, energia lasera przekazywana jest matrycy zmieszanej z badaną próbką i przenoszona na analizowaną substancję, najczęściej stosowane matryce: kwas sinapinowy, kwas a-cyjanohydroksycynamonowy (aCHCA), kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB).

20 MALDI-TOF W wyniku uderzenia laserem próbka ulega jonizacji, co jest warunkiem jej przyśpieszenia w polu elektrycznym, jony analizowane są za pomocą detektora czasu przelotu, w którym jony cięższe docierają do detektora wolniej niż jony lżejsze, wynikiem analizy jest zawsze wartość m/z.

21 MALDI-TOF

22 MALDI-TOF Widmo MALDI TOF mioglobiny końskiej (po lewej) i jej mapy peptydowej powstałej w wyniku trawienia trypsyną (po prawej).

23 MALDI-TOF Zalety techniki: możliwość analizowania substancji
o masach nawet do miliona [Da], dodatek nadmiaru matrycy w stosunku do analitu ogranicza powstawanie agregatów i ułatwia formowanie jonów molekularnych, nie ma potrzeby dostrajania długości fali lasera do częstotliwości absorpcji analizowanych próbek, desorpcja związku zachodzi w łagodnych warunkach, zatem można badać enzymatyczne modyfikacje różnych białek, umożliwia identyfikację białek związanych do macierzy poprzez potraktowanie enzymami proteolitycznymi a następnie analizie otrzymanych peptydów.

24 Surface Plasmon Resonance (SPR)
Surface Plasmon Resonance (SPR) jest techniką, która pozwala na badanie w czasie rzeczywistym oddziaływań międzycząsteczkowych, wiązanie i dysocjacja są mierzone w jednostkach względnych a wyniki są przedstawiane w formie wykresu nazywanego sensorgramem, możliwa jest analiza nie tylko oddziaływań białko-białko, ale także: DNA-DNA, DNA-białko, lipid-białko, itp. Analiza oddziaływań pozwala na określenie: ile cząsteczek bierze udział w oddziaływaniu, siły tego oddziaływania, stałych szybkości asocjacji i dysocjacji. Ponadto możliwa jest analiza ilościowa po wykreśleniu krzywej kalibracyjnej.

25 SPR Główne zalety techniki: możliwość zastosowania
nieznakowanych cząsteczek, możliwość pracy in situ, reagenty po związaniu nie musza być przepłukiwane i suszone przed analizą; ma to szczególne znaczenie do badań oddziaływań o niskim powinowactwie a zatem stabilności.

26 SPR zasada pomiaru Jedna z oddziałujących cząsteczek unieruchomiona zostaje na specjalnym szkle pokrytym warstewką złota, które stanowi jedną ze ścianek cienkiej komórki przepływowej, druga cząsteczka podawana jest w formie rozpuszczonej w odpowiednim buforze i przepływa wraz ze strumieniem cieczy nad powierzchnią złota, światło z zakresu VIS lub IR pada poprzez pryzmat i szklaną płytkę na warstewkę złota, w zależności od otoczenia atomy złota mają różną zdolność do odbijania światła a przez to są bardzo czułe na zmiany zachodzące w ich pobliżu, wynikające na przykład ze związania innej cząsteczki, czułość reakcji atomów złota związana jest z bardzo wydajnym wzbudzeniem elektronów przewodzenia na powierzchni warstewki złota.

27 SPR

28 SPR

29 PODSUMOWANIE                                                        Chipy białkowe mogą dostarczyć wielu interesujących informacji na temat oddziaływań pomiędzy biocząsteczkami, mają one ogromną szansę stać się powszechnym narzędziem także w diagnostyce, rozwój w tej dziedzinie skorelowany jest z rozwojem różnorodnych technik immobilizacji białek, metody, takie jak MALDI-TOF czy SPR, stanowią konkurencyjne i pełne nowych możliwości sposoby analizy chipów białkowych.

30 LITERATURA ‘Protein chips: from concept to practice’ Young-Sam Lee, Milan Mrksich TRENDS in Biotechnology Vol. 20 No. 12, 2002 Adam Dubin, Wprowadzenie do chemii białek, Kraków 2003

31 DZIĘKUJEMY ZA UWAGĘ 