RIBOSOME DISPLAY Ania Grochot.

Prezentacja na temat: "RIBOSOME DISPLAY Ania Grochot."— Zapis prezentacji:

1 RIBOSOME DISPLAY Ania Grochot

2 Dlaczego inne metody są gorsze?
hybrydomy Białko musi być immunogenne ale nie może być letalne Otrzymane przeciwciała są pochodzenia zwierzęcego Faktyczne powinowactwo przeciwciał produkowanych in vivo nie przekracza 1010 M-1 (wyższe powinowactwo nie jest korzystne) Metoda czaso- i pracochłonna 105 – 106 M-1 wczesna odpowiedź immunologiczna 107 – 108 M-1 późna odpowiedź immunologiczna 107 – 1010 M-1 in vivo 1015 M-1 biotyna - awidyna Foote, Eisen Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1254

3 Dlaczego inne metody są gorsze?
Phage display Limit transfekcji – wielkość biblioteki 1010 Białko nie może być toksyczne dla bakterii Trudność elucji fagów niosących przeciwciała z wysokim powinowactwem Wprowadzanie każdej mutacji w genie kodującym przeciwciało wiąże się z rozpoczęciem pracy od początku Metoda czaso- i pracochłonna

4 Okazuje się, że: Istnieje możliwość kotranslacyjnego zwijania białka
in vitro Uwolnienie z rybosomu nie jest konieczne do prawidłowego zwijania białka Białko związane do rybosomu może wykazywać aktywność biologiczną Schaffitzel, Hanes Journal of immun. methods 231,

5 RD? Co to takiego? Ribosome display to pierwsza metoda
screeningu bibliotek (np. HuCAL) i otrzymywania funkcjonalnych białek, prowadzona w całości in vitro; powstające białko jest aktywne, jednocześnie pozostając przyczepionym do kompleksu rybosomu i mRNA.

6 mRNA In vitro transkrypcja DNA In vitro translacja Ekstrakt S30 E.coli
lub z retikulocytów królika RT PCR 5’ 5’ 3’ 3’ Izolacja mRNA Selekcja 5’ 3’ 5’ 3’ dysocjacja

7 Skąd wziąć DNA przeciwciała?
Wyizolować pulę limfocytów Skorzystać z DNA przeciwciała otrzymanego inną metodą Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL) - 7 części zmiennych łańcuchów ciężkich (VH1A, VH1B, VH2-6) i 7 części zmiennych łańcuchów lekkich (Vκ1- Vκ4; Vλ1 – Vλ3) w 49 kombinacjach - Różnorodność przeciwciał wynika ze zmienności w obrębie CDR3, dlatego też CDR3 w tej bibliotece to po prostu przypadkowe trójki nukleotydów - Możliwość otrzymania praktycznie każdego przeciwciała

8 3 podstawowe problemy w RD:
Białko będąc przyczepionym do kompleksu, musi być jednocześnie prawidłowo zwijane Łańcuch białka nie może opuścić kompleksu mRNA nie może opuścić kompleksu 5’ 3’

9 mRNA w ribosome display nie może posiadać kodonu STOP!
Rola kodonu STOP Gdy pojawia się kodon STOP, wtedy kompleks dwóch czynników uwalniających (RF) wiąże się w miejsce tRNA Uwolnienie białka mRNA w ribosome display nie może posiadać kodonu STOP! Hanes, Pluckthun Proc. Natl. Acad Sci. 94, 4937

10 W ribosome display ssrA RNA nie może być obecne!
Rola ssrA RNA C-końcowy fragment białka, które powstaje z mRNA bez kodonu STOP, modyfikowany jest przez ssrA RNA (tmRNA) – dodanie „etykietki degradacji” Uwolnienie białka i degradacja przez specyficzne proteazy W ribosome display ssrA RNA nie może być obecne! Hanes, Pluckthun Proc. Natl. Acad Sci. 94, 4937

11 Linker – bogaty w glicyny i seryny
mRNA LINKER T7 SD VH VL SMYCZ 5’ stem loop 3’ stem loop Primery SD – PCR 1 Primery T7 – PCR 2 T7 – promotor SD – Shine Dalgarno Linker – bogaty w glicyny i seryny Hanes, Pluckthun Proc. Natl. Acad Sci. 94, 4937

12 mRNA In vitro transkrypcja DNA In vitro translacja Ekstrakt S30 E.coli
lub z retikulocytów królika RT PCR Reintrodukcja promotora i SD 5’ 5’ 3’ 3’ Kompleks stabilizowany wysokim stężeniem Mg++ i niską temperaturą Izolacja mRNA Selekcja mRNA eluowane EDTA 5’ 3’ 5’ 3’ dysocjacja

13 3 podstawowe problemy zostają rozwiązane:
Białko będąc przyczepionym do kompleksu, musi być jednocześnie prawidłowo zwijane - dodanie izomerazy mostków disiarczkowych - dodanie koktajlu chapperonowego - C-terminalny linker („smycz”) Łańcuch białka nie może opuścić kompleksu - brak kodonu STOP w mRNA - inhibicja ssrA RNA (oligonukleotydy anty-ssrA) - stabilizacja kompleksu wysokim stężeniem jonów Mg++ mRNA nie może opuścić kompleksu - brak kodonu STOP - inhibitory RNaz - stabilizacja RNA przez struktury stemloop Hanes, Pluckthun Proc. Natl. Acad Sci. 94, 4937

14 Dlaczego RD jest świetną metodą?
Prowadzona w całości in vitro – możliwość dostosowania warunków reakcji do „indywidualnych potrzeb” białka Brak transformacji i jej ograniczeń Możliwość screeningu dużych bibliotek (>1015) Otrzymanie przeciwciał o bardzo wysokim powinowactwie (1013 M-1) - „dojrzewanie” powinowactwa w każdym cyklu Bardzo szybkie cykle (produkty pośrednie nie wymagają oczyszczania; otrzymanie białka nie zależy od stanu hodowli komórkowej) Bardzo czuła W 5 cyklach RD uzyskano 109 krotny wzrost ilości scFv