Instrumentalne Metody Badania Struktury i Aktywności Biomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013.

Prezentacja na temat: "Instrumentalne Metody Badania Struktury i Aktywności Biomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013."— Zapis prezentacji:

1 Instrumentalne Metody Badania Struktury i Aktywności Biomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium
prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013

2 Cel ćwiczenia - zasadniczy
Poznanie w praktyce metodologii / metodyk postępowania dla doboru optymalnego układu rozdzielczego typu HPLC do rozdzielania peptydów / białek i otrzymania frakcji w celu dokonania, następnie, badań struktury molekularnej , właściwości „użytkowych” itp. na przykładzie rozdzielania składników supernatantu hodowli bakteryjnej dla wydzielenia aktywnej formy naturalnych antybiotyków peptydowych (bakteriocyn) – „stafylokokcyn” - „St T”, lub St C”.

3 Cele dodatkowe Poznanie alternatywnych układów LC, umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego – izolacji aktywnej formy naturalnego antybiotyku peptydowego; Poznanie zasad i sposobów określania (wyznaczania / obliczania) oraz doboru („projektowania”) optymalnych wartości „parametrów operacyjnych” dla wybranych alternatywnych układów rozdzielczych, potencjalnie umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego; Zespołowe rozwiązywanie problemów oraz zespołowa praca nad przygotowaniem raportu z badań Poznanie „techniki” LC/HPLC i najważniejszych problemów, które mogą mieć miejsce

4 Zasada realizacji ćwiczenia oraz przygotowania sprawozdania – raportu z badań
Praca eksperymentalna w „podgrupach” Zespołowe opracowanie wyników przez podgrupy przygotowanie części sprawozdania / raportu z badań podgrupy, wraz z wynikami obliczeń najważniejszych parametrów operacyjnych i wnioskami, wynikającymi z badań podgrupy Zespołowe opracowanie sprawozdania całej grupy oraz opracowanie zależności / wniosków dodatkowych tzn., „części spinającej” badania w podgrupach, ew. obliczenie / wyznaczenie dodatkowych parametrów / zależności funkcyjnych możliwych do określenia dopiero na podstawie badań poszczególnych podgrup – łącznie oraz sformułowanie dodatkowych wniosków

5 Etapy procedury, skala operacji, układy rozdzielcze, opis warunków i parametry operacyjne rozdzielania Przygotowanie „wsadu” / „pre-rozdzielanie” / rozdzielanie „właściwe” jedno-, najczęściej, wielo-etapowe z zastosowaniem detekcji - jeden, albo kilka detektorów HPLC, połączonych szeregowo lub równolegle / kontrola czystości frakcji (z zastosowaniem „analityki instrumentalnej , w tym, HPLC) / kontrola aktywności antybiotycznej), // wydzielanie „produktu” / „doczyszczanie” (poza ramami czasowymi ćwiczenia) Skala modelowa / powiększanie skali rozdzielania (poza ramami czasowymi ćwiczenia) GPC / SEC – H (war. hydrofilowe) – rozdzielanie wstępne, odsalanie; RP / HILIC // IExC / IExcl – (jedna z tych odmian chromatografii nieprzydatna dla peptydów i białek – która ?) Parametry „operacyjne” - rodzaj sorbentu / powierzchnia sorpcyjna (A), wielkość porów (d/ Δd), kształt i wielkość ziaren wypełnienia kolumn/y (dp / Δdp), natężenie przepływu eluentu (w) / liniowa prędkość (u) / średnica (dc), długość kolumny (Lc), stężenie roztworu dozowanego (Cmix) / objętość dozowana (Vi) rozpuszczalnik roztworu dozowanego , korzystnie - w przeliczeniu na jednostkę masy / objętości / powierzchni wypełnienia kolumny // jednostkę przekroju poprzecznego kolumny

6

7 „TECHNIKA”

8 Przykłady otrzymanych przez Państwa wyników rozdzielania, przebiegu chromatogramów, widm UV-VIS / RID - do opracowania, sformułowania wniosków w sprawozdaniach podgrup / grup laboratoryjnych

9 PRE-rozdzielanie / odsalanie GPC/SEC – H kolumna HPLC – DIOL 100

10 RP-HPLC – elucja gradientowa, detekcja UV-VIS-DAD
Możliwość określenia widm / identyfikacji wstępnej na podstawie UV-VIS (proszę zwrócić uwagę na : ewentualność wykluczania, wartość długości fali w maksimum widm, okoliczność absorpcji światła UV przez St-T/St-C do 305 nm / ewentualność wytrącania się składników mieszaniny dozowanej w momencie dozowania do kolumny, zakres zmienności wartości molowych współczynników absorpcji światła składników.

11 Zestawienie chromatogramów różnych wsadów

12 Pik „32,96 min” – składniki o wysokiej hydrofobowości pozostałe w kolumnie po elucji „St” , eluowane w warunkach zwrotnego przepływu eluentu Warunki RP - integrator, zbieranie frakcji; Stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie; Kolejno - badanie czystości frakcji / aktywności a-biotycznej ;

13 Zestawienie widm UV kilku peptydów

14 Nałożenie chromatogramów rozdzielania w tych samych warunkach - RP , elucja izokratyczna

15 Kolumna Accucore – HILIC – układ ortogonalny względem RP
Warunki HILIC, elucja izokratyczna – należy preferować elucję izokratyczną w P-LC / P-HPLC, w przypadku rozdzielania peptydów / białek elucja gradientowa może zapewniać lepszą selektywność rozdzielania Kolumna Accucore – HILIC – układ ortogonalny względem RP

16 Chromatogramy dla kilku różnych długości fali światła UV

17 Nałożenie chromatogramów – dwie różne bakteriocyny – St T i St C – HILIC warunki izokratyczne

18 Oznaczenie czystości frakcji
Możliwość stosowania nowoczesnych technik chemii analitycznej, w tym HPLC-UV-VIS/DAD; Identyfikacja na podstawie czqasu retencji, oraz dodatkwo, z zastosowaniem widm UV-VIS dzięki detektorowi DAD; Korzystne stosowanie układów „ortogonalnych” , np., rozdzielanie – RP / oznaczanie czystości frakcji / produktu – HILIC lub NP..

19

20 Badanie aktywności antybiotycznej
Płytka #2 Badanie aktywności antybiotycznej Nr krążka Frakcja Strefa zahamowania wzrostu (intensywność +/-,+,++, +++) Dodatkowe informacje 1 F VI 11,8-14,41 +++ Staf T ACN:H2O 3:7 + 0,075% TFA (HP1050) 2 F II 3,3-5 Brak 3 F I 2,15-3,3 + 4 F III 5,0-6,1 5 F IV 6,1-9,1 +/- 6 F V 9,1-11,8 ++ 7 F VIII BF 33,7-42,0 8 F VII 14,4-17,0 9 F 2 2,6-5,8 Staf C ACN:H2O 3:7 +0,075% TFA (HP1050) 10 F 5 12,2-20,0 11 F 3 5,8-8,2 12 F 4 8,5-11,6 13 F 1 1,95-2,6 14 BF 37,0-45,0 15 5 1,86-4,44 ACN:H2O, 2 część frakcji gr. P. Czerniejewska 16 8 7,52-8,46 17 1 0,49-0,77 18 2 0,87-1,74 19 6 4,45-4,64 20 7 4,65-7,50

21 Przykłady rezultatów badania aktywności anty-biotycznej – wartości zahamowania strefy wzrostu kolonii bakteryjnej U góry - widok płytki z rezultatami badania aktywności a–biotycznej frakcji; Obok – zahamowanie sterfy wzrostu kolonii bakteryjnej w świetle przechodzącym

22 Problem braku korekty opóźnienia transportowego dla programu elucji
- w przypadku niniejszego rozdzielania - najpierw brak „korekty”, potem zbyt „stromy” program elucji