Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka

Prezentacja na temat: "Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka"— Zapis prezentacji:

1 Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka
Produkt protoonkogenu c-mos częściowo degradowany po uwolnieniu z bloku metafazy drugiego podziału mejotycznego i utrzymywany podczas interfazy w zygocie myszy Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka

2 Wstęp

3 Badania na płazach W niezapłodnionych komórkach jajowych kregowców, cykl komórkowy jest zatrzymany w metafazie drugiego podziału mejotycznego (metafaza II) przez czynnik cytostatyczny CSF W metafazie II, kiedy CSF jest aktywny, aktywność MPF jest wysoka i pozostaje nienaruszona Oocyt zostaje uwolniony z bloku metafazowego po zapłodnieniu lub aktywacji Produkt protoonkogenu c-mos jest zaangażowany w aktywność CSF Bialko Mos jest obecne w dużych ilościach w oocycie w metafazie II i nie zostało wykryte w zapłodnionych komórkach Białko Mos może być degradowane po zapłodnieniu lub aktywacji przez proteazę kalpainową zależną od wapnia

4 Badania na myszach Działanie CSF nie zostało dowiedzione
Wykazano, że blok metafazowy zależy od syntezy pewnych białek Zarówno c-mos mRNA jak i jego produkt (białko p39mos) są obecne w oocycie od wczesnych stadiów pęcherzyka zarodkowego do stadium metafazy II, kiedy to następuje zatrzymanie cyklu komórkowego Wstrzyknięcie do oocytu w stadium pęcherzyka zarodkowego c-mos-specyficznych antysensownych oligonukleotydów zapobiega wyrzuceniu I ciałka kierunkowego i przejściu do metafazy drugiego podziału mejotycznego

5 Materiały i metody 5-6 tygodniowym samicom myszy podano 5 IU oraz (48h później) hCG Owulowane oocyty uzyskano 14 i 16 h po podaniu hCG przez nakłuwanie ampuli jajowodów w roztworze hialuronidazy Oocyty zaktywowano 18 h po podaniu hCG przez 6,5 min.ekspozycję w 8% alkoholu Komórki hodowano w pożywce M2 pod parafiną w 37 0C Zapłodnione komórki jajowe uzyskano przez połączenie samic z samcami i wyizolowanie z jajowodów 25-27h po podaniu hCG Do obserwacji wczesnych etapów (wyrzucenie ciałka kierunkowego, formowanie przedjądrza) wybrano, ze względu na lepszą synchronizację, jaja aktywowane w alkoholu

6 Materiały i metody c.d Badano aktywność kinazy histonu H1(cdc2) (badanie aktywnosci MPF) w HK buforze przy użyciu egzogennych histonów H1. Odpowiednio przygotowane próbki poddano eloktroforezie na 15% żelu poliakrylamidowym Zaktywowane oocyty po wyrzuceniu ciałek kierunkowych poddano immunoprecypitacji używając przeciwciał skierowanych przeciwko cyklinie B. Próbki badano na 10% żelu poliakrylamidowym W celu stwierdzenia obecności produktu genu c- mos zastosowano immunoblotting

7 Wyniki

8 Aktywność kinazy histonu H1(cdc2)
1-oocyty w bloku metafazy II 2-oocyty zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego 3-oocyty 5-7 h po aktywacji (G1) 4-oocyty h po zapłodnieniu (S)

9 Wniosek aktywność MPF (wyrażona aktywnością kinazy cdc2)
spada gwałtownie po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

10 Degradacja cykliny B w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego
1-oocyty kontrolne 2-komórki tuż po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego

11 Wniosek Ponad 65% cykliny B jest degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego

12 Eksperyment (immunoblot ) pokazujący obecność białka Mos w oocytach
Rysunek lewy oocytów w metafazie II: oocytów we wczesnej interfazie (zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego): oocytów w póżnej fazie G1: oocytów w fazie S Rysunek prawy 125, 250, 500 ,750 oocytów w metafazie II

13 Spostrzeżenia Ilość Mos po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego jest podobna do ilości obserwowanej w metafazie II (87%) Ilość Mos w fazie G1 i w późnej fazie S znacznie się zmniejszyła (pozostało jedynie 23% białka obecnego w metafazie II)

14 Wniosek Białko Mos nie jest w znaczący sposób degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego => jest degradowane później, podczas fazy G1 Około 23% białka Mos nie jest degradowane i jest obecne podczas 1 cyklu mitotycznego w zygocie

15 Podsumowanie

16 U płazów, produkt protoonkogenu c-mos jest kluczowym katalitycznym komponentem CSF; celem kinazy Mos może być cyklina B, regulatorowa podjednostka MPF U myszy białko Mos jest syntetyzowane w dojrzewających oocytach, ale nie w zygocie; c-mos RNA jest degradowane podczas dojrzewania mejotycznego U obu gatunków, podczas zapłodnienia, CSF powinien być inaktywowany, żeby umożliwić dalszy rozwój => Nie ma jednak bezpośrednich dowodów, że CSF jest inaktywowany podczas wyjścia z bloku metafazy II

17 Istnieją dwie możliwości:
1.inaktywacja CSF jest konieczna do wyjścia z II podziału mejotycznego 2.aktywacja powoduje zniszczenie cykliny w sposób, który nie może być zablokowany przez aktywny CSF W 2. Przypadku destrukcja CSF ma miejsce póżniej, podczas pierwszego cyklu, i ten przypadek, jak wynika z badań, dotyczy myszy

18 Mos jest kluczowym, katalitycznym składnikiem czynnika cytostatycznego (CSF) =>
Istnieją dwie potencjalne możliwości inaktywacji CSF: 1.zmiana aktywności białka Mos 2.degradacja Mos przez proteazę kalpainową zależną od wapnia W 2.przypadku aktywacja proteazy mogłaby zachodzić w momencie napływu wapnia, który ma miejsce zaraz po zapłodnieniu.

19 Degradacja produktu c-mos ma miejsce po degradacji cykliny B i inaktywacji MPF.
Jeśli inaktywacja CSF ma związek z destrukcją białka Mos oznacza to, że inaktywacja CSF nie jest konieczna do wyjścia z bloku metafazowego. Degradacja Mos podczas fazy G1 1.cyklu komórkowego zygoty może być konieczna, aby uniknąć bloku metafazowego podczas mitotycznych podziałów Jeśli inaktywacja CSF jest wymagana do wyjścia z bloku metafazy II, to nie ma ona związku z degradacją Mos, tylko raczej z mechanizmem regulacyjnym, który modyfikuje aktywność CSF (np. przez zmianę stanu fosforylacji Mos) 23% białka Mos obecnego w metafazie II jest w zygocie jeszcze w późnej fazie S (częściowo mogą to być nowo zsyntetyzowne białka, ponieważ pewne ilości c-mos mRNA są obecne na tym etapie) Niewielkie ilości Mos obecnego w zygocie mogą odgrywać rolę podczas przejścia z fazy G2 do M

20 Koniec