QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska

QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska

Genom M. tuberculosis zawiera 4000 genów
104 geny nieobecne w szczepionce BCG 40 genów niewystępujących u innych Mycobacteria 6-8 silnie immunogenne

Antygeny specyficzne dla M. tuberculosis kodowane przez RD
Antygeny typowo gruźlicze Antygeny M.tuberculosis Antygeny specyficzne dla M. tuberculosis kodowane przez RD Antygeny w szczepionce BCG Antygeny innych mycobacteria

Wybór antygenów ESAT-6 (early secreted antigenic target 6 kD protein) i CFP-10 (culture filtrate protein 10 ) oraz peptyd TB7.7 (Rv2645, d-ribose, 5-phosphate isomerase) ESAT-6 i CFP-10 swoiste dla gruźlicy (swoistość 99.2%, QFT Gold Package Insert (US)) TB7.7(p4) bardzo wysoka swoistość (534/535; 99.8% - potwierdzona w testach) 20 do 30% odpowiedzi wśród pacjentów zakażonych Antygeny w probówce Dodatkowy (synergiczny) efekt wzmacnia odpowiedź Nakładające się peptydy (10aa) długości 25merow Zminimalizowane ryzyko kontaminacji (np. endotoksyny) oraz kontrola jakości przeprowadzonego testu Długie peptydy o >95% czystości, by zmierzyć odpowiedz CD4 Można użyć krótszych lub mniej oczyszczonych peptydów i mierzyć także odpowiedź CD8, ale rola tych komórek w diagnostyce jest niejasna

RD1 Locus i ESX-1 System ESAT-6 oraz CFP-10 są wydzielane jako dimer
Ernst JD, et al. J Clin Invest 2007;117:

Właściwości specyficzne dla antygenów gruźliczych
ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) kodowane przez geny RD nie występują w szczepionce BCG nie występują u większości NTM indukują odpowiedź IFN-

BCG Historical Genealogy
Loss of RD 1 region in BCG Science 1999;284:

QFT: brak reakcji krzyżowej z BCG/TST
Tuberculosis Complex ESAT-6 CFP-10 TB-7.7 Environmental Strains M. tuberculosis + M. abcessus - M. africanum M. avium M. bovis M. branderi M. celatum BCG Substrain M. chelonae Gothenberg M. fortuitum Moreau M. gordonii Tice M. intracellulare Tokyo M. kansasii Danish M. malmoense Glaxo M. marinum Montréal M. oenavense Pasteur M. scrofulaceum M. smegmatis M. szulgai M. terra M. vaccae M. xenopi

Mechanizm immunologiczny w technologii QFT
U osób zakażonych prątkiem gruźlicy limfocyty reagują odpowiedzią imunnologiczną na antygeny gruźlicze Technologia QuantiFERON® wykorzystuje stymulację próbek krwi specyficznymi antygenami Komórka prezentująca antygen (APC) napotyka antygen który wchłania i trawi

Mechanizm immunologiczny w technologii QFT
W odpowiedzi na stymulacje antygenami limfocyty T wydzielają interferon gamma Technologia QuantiFERON® pozwala zmierzyć poziom sekrecji IFN- jako narzędzie do wykrywania zakażenia APC prezentuje antygen limfocytom T Aktywowane limfocyty T wydzielają IFN-γ.

Nowoczesna diagnostyka zakażenia gruźliczego mierzy IFN-
IFN-   CMI (Cellular Mediated Immune Response) Limfocyty T wydzielają IFN- po stymulacji przez antygeny Mierzalna sekrecja Nie występuje w krążeniu

Odpowiedź immunologiczna podczas infekcji TB
Już w 2 tygodnie po infekcji można zmierzyć CMI. Wykrycie antygenów i przeciwciał jest możliwe dopiero w aktywnym stadium gruźlicy. Modified from Anderson P et al. Trends Mol Med. 2007; 13: Szary obszar = mierzalna odpowiedz w teście diagnostycznym

D:\Users\MSokolowska\Desktop\QuantiFERON TB Product Overview PL2.pptx

QFT probówki do pobrania krwi i odczynniki ELISA

Pobierz 1ml do każdej probówki.
Etap 1. Pobranie krwi Pobierz 1ml do każdej probówki. Przytrzymaj probówkę na igle przez 2-3 sekundy po zaprzestaniu przepływu.

Krew należy pobierać w temp. 17-25 ºC
Pobranie krwi Krew należy pobierać w temp ºC Dopuszczalna objętość krwi w probówce 0.8 – 1.2 ml

Pobranie krwi Czarna linia na etykiecie wskazuje 1ml objętości. Jeśli poziom krwi w każdej probówce nie jest zbliżony do linii wskaźnikowej, zaleca się ponowne pobranie.

2) Wstrząsanie probówek
Natychmiast po napełnianiu probówek, wstrząsnąć je 10 razy Wstrząsnąć wystarczająco mocno, aby zapewnić pokrycie całej wewnętrznej powierzchni probówki

Wstrząsanie probówek Uwaga!
- Zbyt mocne wytrząsanie może powodować oderwanie żelu i może prowadzić do nieprawidłowych wyników.

3) Inkubacja/Transportowanie: Opcja :1Inkubacja w miejscu pobierania
Inkubować w miejscu pobierania (pionowo w temperaturze 37 ° C przez godziny) Następnie przesłać do laboratorium w temperaturze 4 – 27 ° C Opisać jako "inkubowane"

Inkubacja/ Trasportowanie: Opcja 2: Inkubacja w laboratorium
Właściwy transport do laboratorium w °C Krew musi być inkubowana w temperaturze 37 ° C, tak szybko jak to możliwe i nie później niż 16 godzin od pobrania Opisać jako "nie inkubowane"

CHEST 2012 Meta-analysis published in CHEST which is published by the American College of Chest Physicians on the subject of chest diseases and related issues.

Flow diagram for study selection: inclusion and exclusion criteria for relevant citations
In order to compare „apples with apples“ rigid inclusion and exclusion criteria were applied. Initially, 241 studies have been looked at. However, the vast majority had either no real TB relevance, were case reports (i.e. anecdotes) or focussed on patients that have been put on treatment.

Wartość predykcyjna IGRA dla progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach w % (komercyjne IGRA) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Clark (0.01 – 0.32) 2/20 Aichelburg (0.02 – 0.22) 3/36 Haldar (0.11 – 0.26) 19/110 Kik (0.01 – 0.06) 5/178 (0.01 – 0.07) 6/181 Lee (0.00 – 0.22) 0/15 (0.00 – 0.38) 1/12 Diel (0.08 – 0.19) 19/147 Harstad (0.01 – 0.05) 6/238 Jonnalaggada (0.02 – 0.11) 6/110 Leung (0.04 – 0.13) 12/151 Thomas (0.00 – 0.03) 0/107 Bradshaw (0.00 – 0.09) 0/37 Kim (0.02 – 0.14) 4/71 Mahomed (0.01 – 0.02) 39/2669 Song (0.07 – 0.36) 6/32 Yoshiyama (0.00 – 0.01) 4/945 Torres Costa (0.04 – 0.14) 9/119 Zhang (0.00 – 0.21) 0/16 Pooled PPV for progression = (0.023 to 0.032) Chi-square = ; df = 18 (p = ) Inconsistency (I-square) = 89.5 % PPV (95% CI) n/N Graph lists all studies that have been looked at for the PPV of IGRAs. Pooled PPV for progession = means 2.7%.

Wartość predykcyjna próby tuberkulinowej dla progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach w % 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Higuchi (0.00 – 0.04) 0/95 Bakir (0.01 – 0.10) 3/83 Hill (0.01 – 0.03) 14/843 Lee (0.00 – 0.25) 1/20 Higuchi (0.00 – 0.03) 0/200 Kik (0.01 – 0.05) 8/288 Diel (0.02 – 0.05) 17/555 Harstad (0.01 – 0.03) 6/415 Leung (0.03 – 0.12) 9/136 Thomas (0.00 – 0.04) 0/100 Song (0.02 – 0.13) 6/99 Chang (0.00 – 0.21) 0/16 Lienhardt (0.01 – 0.04) 16/629 Silvermann (0.00 – 0.26) 0/12 Torres Costa Mahomed (0.00 – 0.00) 4/2094 (0.01 – 0.02) 40/2894 PPV (95% CI) n/N Pooled PPV for progression = (0.012 to 0.017) Chi-square = 89.22; df = 15 (p = ) Inconsistency (I-square) = 83.2 % PPV for progression TST The author then compared the estimated PPV for TST.

Wartość predykcyjna IGRA dla progresji do gruźlicy w grupach ryzyka w %
PPV for progression commercial IGRAs 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Clark (0.01 – 0.32) 2/20 Aichelburg (0.02 – 0.22) 3/36 Haldar (0.11 – 0.26) 19/110 Kik (0.01 – 0.06) 5/178 (0.01 – 0.07) 6/181 Lee (0.00 – 0.22) 0/15 (0.00 – 0.38) 1/12 Diel (0.08 – 0.19) 19/147 Harstad (0.01 – 0.05) 6/238 Jonnalaggada (0.02 – 0.11) 6/110 Leung (0.04 – 0.13) 12/151 Kim (0.02 – 0.14) 4/71 Song (0.07 – 0.36) 6/32 Yoshiyama (0.04 – 0.14) 9/119 Zhang (0.00 – 0.21) 0/16 Pooled PPV for progression = (0.056 to 0.083) Chi-square = 50.30; df = 14 (p = ) Inconsistency (I-square) = 72.2 % PPV (95% CI) n/N The authors stratified PPV based on risk groups as it really makes sense to focus on individuals that do have a higher risk to progress to active TB.

Wartość predykcyjna proby tuberkulinowej dla progresji do gruźlicy w grupach ryzyka w %
0.2 0.4 0.6 0.8 1 Higuchi (0.00 – 0.04) 0/95 Bakir (0.01 – 0.10) 3/83 Hill (0.01 – 0.03) 14/843 Lee (0.00 – 0.25) 1/20 Higuchi (0.00 – 0.03) 0/200 Kik (0.01 – 0.05) 8/288 Diel (0.02 – 0.05) 17/555 Harstad (0.01 – 0.03) 6/415 Leung (0.03 – 0.12) 9/136 Song (0.02 – 0.13) 6/99 Chang (0.00 – 0.21) 0/16 Lienhardt (0.01 – 0.04) 16/629 Silvermann (0.00 – 0.26) 0/12 PPV (95% CI) n/N Pooled PPV for progression = (0.019 to 0.029) Chi-square = 32.87; df = 12 (p = ) Inconsistency (I-square) = 63.5 % Same graph for the TST.

Ujemna wartość predykcyjna IGRA dla predykcji progresji do gruźlicy we wszystkich badanych populacjach % (ujemny wynik IGRA) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Clark (0.92 – 1.00) 0/47 Higuchi (0.96 – 1.00) 0/91 Silvermann (0.74 – 1.00) 0/12 Aichelburg (1.00 – 1.00) 0/749 Kik (0.94 – 1.00) 3/149 (0.94 – 1.00) 2/118 Haldar (1.00 – 1.00) 0/835 Higuchi (0.99 – 1.00) 0/300 Lee (0.64 – 0.99) 2/17 (0.75 – 1.00) 1/20 Diel (1.00 – 1.00) 0/759 Harstad (0.99 – 1.00) 0/576 Leung (0.94 – 1.00) 1/90 Thomas (0.98 – 1.00) 0/195 Bradshaw (0.99 – 1.00) 0/394 Chang (0.95 – 1.00) 0/70 Kim (0.98 – 1.00) 0/201 Mahomed (0.99 – 1.00) /2575 Santin (0.97 – 1.00) 0/105 Schablon (0.98 – 1.00) 0/154 Song (0.95 – 1.00) 0/67 Torres Costa (1.00 – 1.00) 0/1931 Yoshiyama (0.99 – 1.00) 19/2683 Zhang (0.79 – 1.00) 0/16 NPV (95% CI) n/N Pooled NPV for progression = (0.995 to 0.998) Chi-square = 78.28; df = 23 (p = ) Inconsistency (I-square) = 70.6 % NPV value for IGRAs and TST are both very high; i.e. likelihood of progression to active TB based on a QFT neg or TST neg is almost 0.

Negative predictive value for TST for predicting progression to TB disease in all study populations in % 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Higuchi (0.99 – 1.00) 0/254 Bakir (0.98 – 1.00) 3/358 Hill (0.99 – 1.00) 11/1387 Higuchi (0.97 – 1.00) 0/106 Kik (0.93 – 1.00) 0/51 Lee (0.62 – 1.00) 1/12 Diel (0.98 – 1.00) 2/348 Harstad (0.99 – 1.00) 0/394 Leung (0.91 – 0.99) 4/105 Thomas (0.98 – 1.00) 0/201 Lienhardt (0.96 – 0.99) 5/264 Mahomed (0.99 – 1.00) 12/2350 Chang (0.95 – 1.00) 0/71 Kim (0.96 – 1.00) 4/270 Santin (0.97 – 1.00) 0/109 Song (0.99 – 1.00) 10/1556 Torres Costa (1.00 – 1.00) 0/782 NPV (95% CI) n/N Pooled NPV for progression = (0.992 to 0.995) Chi-square = 43.99; df = 16 (p = ) Inconsistency (I-square) = 63.6 %

Head-to-head comparison of PPV of commercial IGRAs versus TST in untreated persons
Study Year Sample Country n/N; IGRA (%) IGRA used n/N; TST (%) PPV difference between IGRA and TST, percentage points Lee et al. 2009 Hemodialysis patients Taiwan 1/12 (8.3) QFT-G 1/20 (5.0) +3.3 0/15 (0.0) T-Spot -5.0 Diel et al. 2010 Contact persons Germany 19/147 (12.9) QFT-IT 17/555 (3.1) +9.8 Harstad et al. Asylum seekers Norway 6/238 (2.5) 6/415 (1.4) +1.1 Kik et al. Netherlands 6/181 (3.3) 8/288 (2.8) +0.5 5/178 (2.8) ±0.0 Leung et al. Silicosis patients Hong Kong 12/151 (7.9) 9/136 (6.6) +1.3 Song et al. 2011 School contacts South Korea 6/32 (18.8) 6/99 (6.1) +12.7 Thomas et al. Adolescents Bangladesh 0/107 (0.0) 0/100 (0.0) Mahomed et al. South Africa 39/2669 (1.5) 40/2894 (1.4) +0.1 Torres Costa et al. Healthcare workers Portugal 4/945 (0.4) 4/2094 (0.2) +0.2 98/4675 (2.1) 100/6909 (1.4) P = 0.01 This graph points out that in IGRAs outperformed TST with regards to PPV in almost every listed study. In addition, it shows that there are signficiant differences between IGRAs and TST in high risk groups (Diel et al, Song et al etc)

Łączna PPV dla progresji w badaniach z użyciem OT wyniosła 1.5%.
Wnioski: Łączna PPV dla progresji we wszystkich badaniach z użyciem komercyjnych testów IGRA wynosiła 2.7%. Łączna PPV dla progresji w badaniach z użyciem OT wyniosła 1.5%. PPV dla progresji w grupach wysokiego ryzyka badanych testem IGRA wynosiła 6.8%. PPV dla progresji w grupach wysokiego ryzyka z użyciem OT wyniosła 2.4% Łączna wartość NPV dla progresji w obu testach była bardzo wysoka: 99.7% i 99.4%, lecz znacząco wyższa dla IGRA [p<0.01]. Summary of the graphs

Wartość predykcyjna dla IGRA prawie 2x wyższa we wszystkich badaniach
Wnioski: Wartość predykcyjna dla IGRA prawie 2x wyższa we wszystkich badaniach Wartość predykcyjna dla IGRA prawie 3x wyższa w grupach wysokiego ryzyka Ujemna wartość predykcyjna dla IGRA statystycznie wyższa Self explanatory. Komercyjne testy IGRA potwierdziły wyższą wartość predykcyjną dla progresji do aktywnej gruźlicy w porównaniu do próby tuberkulinowej, szczególnie w grupach wysokiego ryzyka

Dziękuję za uwagę.

Etap 1 – Stymulacja krwi i zebranie osocza
Odwirować przy prędkości – 3000 g (RCF) przez 15 minut przed po Po odwirowaniu probówki mogą być przechowywane do 4 tygodni w temperaturze 2-8 °C (dłużej w -70)

Etap 1 – Stymulacja krwi i zebranie osocza
Próbki mogą być pobierane bezpośrednio z probówek ręcznie W platformach automatycznych

iii. ELISA

Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA)
Wyjąć odczynniki z lodówki na 1 godz przed rozpoczęciem badania (17-27 stopni Celsjusza) Koniugat musi pozostać w lodowce

Rozpuścić standard w objętości wody destylowanej wskazanej z boku fiolki (do stężenia końcowego 8 IU/mL) Rozpuścić 100x stężony koniugat w 300μL wody destylowanej

Etap 2 – Pomiar poziomu IFN- γ (ELISA) 4-punktowa krzywa wzorcowa
Poza USA QuantiFERON jest oparty na 4-punktowej krzywej wzorcowej In the US the FDA has approved an 8-pt curve, but indicated that an alternative dilution series may be used as long as it has been validated by the laboratory. Consequently, it is acceptable to adhere to the 4-pt instructions in the US as well. The interpretation criteria for QuantiFERON are the same for both standard curves.

Przygotowanie krzywej wzorcowej 150 mL (standard wyjsciowy) 8.0 IU/mL Standard 4 0 IU/mL (tylko GD) Standard 1 4.0 IU/mL Standard 2 1.0 IU/mL Standard 3 0.25 IU/mL 50 mL S3 S4 S2

Stage 2 – Human IFN- γ ELISA
Prepare standard curve as per the Package Insert 8-point curve for 3G (US-version) Reconstituted Kit Standard Standard 8 (Green Diluent) (zero) Standard 2 4.0 IU/mL Standard 3 2.0 IU/mL Standard 4 1.0 IU/mL Standard 5 0.50 IU/mL Standard 6 0.25 IU/mL Standard 7 0.125 IU/mL Standard 1 8.0 IU/mL 150 mL 300 mL

Przygotować koniugat roboczy wg instrukcji Dodać 50μL koniugatu roboczego do każdego dołka

Dodać 50μL osocza i wzorca do odpowiednich dołków

Wytrząsać płytkę przez 1 minutę

Inkubować 120 minut w temperaturze 22 ± 5ºC Z dala od działania światła i ciepła

Wypłukać płytkę 6 razy Usunąć pozostały bufor płuczący wystukujac płytkę o ręcznik papierowy Dodać 100µL substratu enzymu

Wytrząsać płytkę przez 1 minutę

Inkubować 30 minut w temperaturze 22 ± 5ºC Z dala od słońca i źródeł ciepła

Dodać 50μL roztworu hamującego do każdego dołka

Odczytać poziom OD dla filtra 450nm i 620 – 650nm jako referencji

Płytki QFT sa pokryte przeciwciałami anty-INF Anti-Human IFN- γ Antibody

Anti-Human IFN- γ Antibody Anti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP

Anti-Human IFN- γ Antibody Anti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP IFN- γ

Jeśli IFN-γ jest obecny, przeciwciała tworzą kompleksy, a niezwiązany materiał jest wymywany Anti-Human IFN- γ Antibody Anti-Human IFN- γ Antibody Conjugated to HRP IFN- γ

Po dodaniu substratu: IFN-γ obecny → zmiana koloru na niebieski brak IFN- γ → brak zmiany koloru

Po dodaniu roztworu hamującego IFN-γ obecny → zmiana koloru na żółty Brak IFN- γ → brak zmiany koloru

Analiza danych z oprogramowaniem QFT

Etap 2 – ELISA - wyniki Obliczenia wyników przy użyciu oprogramowania do analizy QuantiFERON ®

Teoria Oprogramowanie używa pomiarów OD S1 – S3 do generowania krzywej wzorcowej S1 S2 S3 Sample IU/mL IFN- γ (IU/mL) OD Sample OD Wychadzac od krzywej wartość INF γ w IU/mL może być ustalona dla każdej próbki OD

Theory Software uses the ODs of S1 – S7 to generate a standard curve (US-version) S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 IFN- γ (IU/mL) OD Sample IU/mL Sample OD From this curve an IFN-γ IU/mL value can be determined for each sample OD

Tabela szczegółowych wyników
Data Nr testu Nr seryjny Operator

Tabela danych wyjsciowych
“Wklej dane” Wybierz przycisk domyślny Format (lub wybierz ręcznie lub za pomocą przycisku "Poprzedniego formatu") Opisz probki “Oblicz wyniki”

Współczynnik korelacji
Kontrola jakości Obejmuje OD i % CV dla każdego z punktów krzywej wzorcowej Współczynnik korelacji Wykreślenie krzywej Prawidłowe lub nieprawidłowe ELISA

Tabela wynikow Wyniki w IU/mL dla każdego badanego

Eksport danych i wyników
Funkcje dodatkowe Raporty mogą być drukowane lub zachowywane jako pliki pdf zbiorczo indywidualnie Eksport danych i wyników

Skrócony przewodnik po oprogarmowaniu

Allows easy analysis of multiple plates
Further Analysis Selecting “New Test” returns to the “Run Details” tab all information is remembered, except for the Run Number Allows easy analysis of multiple plates

QuantiFERON® -TB Gold Trouble Shooting

QuantiFERON®-TB Gold 3G
Blood Incubation and Plasma Harvesting Blood and antigen mixing is very important Blood should be mixed properly! When harvesting, a small amount of haemolysis or RBCs is OK 487 mg/dL amount of haemoglobin has been shown to not affect the assay Other Interfering substances have also been examined and have been shown to have no affect: Bilirubin (19.7 mg/dL free & 21.8 mg/dL conjugated) Problem Solving

ELISA Inadequate or incorrect washing is the most common cause of QFT ELISA error. Wash volumes should: Reach top of each well Positive meniscus (if possible) Blocked washer probes can be cleaned with a fine wire. Minimum of 6 complete washes are suggested as a minimum, however additional washes can be performed without affecting the performance of the assay. A soak period of at least 5 seconds between each cycle is recommended. Problem Solving

ELISA - Non specific Colour Development Incomplete washing of plate Wells filled Blocked Probes Number of Cycles Soak Time Cross-contamination of ELISA wells Careful mixing Gently place plate down Problem Solving

ELISA – High Background Incomplete washing of plate Conjugate reconstitution/dilution error Reconstitute with 300μL of water Dilute as per Table in Package Insert Incubation temperature too high Incubation should be at room temp ( ºC) Problem Solving

ELISA – Low Absorbance Incubation temperature too low Incubation should be at room temp ( ºC) Incubation time too short Primary incubation 120 minutes Secondary Incubation 30 minutes Reagents cold Equilibrate for 1 hour Substrate mixed too vigorously Mixed by gentle inversion Incorrect filters in reader 450/ nm Problem Solving

ELISA – Poor Standard Curve Incomplete washing of plate Standard dilution error Dilute as per Table in Package Insert S1 is neat standard Inconsistent pipetting technique Ensure pipettes set to correct volume Ensure no bubbles in pipette tips Avoid holding multichannel pipette on angle Problem Solving

Problem Solving Repeat testing inconsistent Close to cut-off?
Results Interpretation High Nil results High circulating IFN-γ Contamination e.g. tubes, butterflies, syringes Problem Solving Repeat testing inconsistent Close to cut-off? ELISA technical issue

Problem Solving Low Mitogen Patient population Inadequate mixing
Results Interpretation Mitogen off-scale (software reports > 10 UI/ml) Normal, no impact of outcome of test Problem Solving Low Mitogen Patient population Inadequate mixing Inappropriate handling Incubated within >16 hours Not transported at room temperature

QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska

Podobne prezentacje

Prezentacja na temat: "QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska"— Zapis prezentacji:

Podobne prezentacje

О projekcie

Zwrotny adres

Wejść

Zaloguj się poprzez sieć społeczną:

QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska

Podobne prezentacje

Prezentacja na temat: "QuantiFERON ®-TB Gold Martyna Sokolowska"— Zapis prezentacji:

Podobne prezentacje

О projekcie

Zwrotny adres