Heteroduplex Heteroduplex mobility assay

Prezentacja na temat: "Heteroduplex Heteroduplex mobility assay"— Zapis prezentacji:

1 Heteroduplex Heteroduplex mobility assay
Biotechnologia III rok Sylwia Borkowska Małgorzata Gawlik Piotr Gawroński

2 Definicja Heteroduplex jest dwuniciową molekułą kwasu nukleinowego powstającą podczas rekombinacji homologicznej z pojedynczych komplementarnych nici, pochodzących z różnych źródeł, np. z dwóch homologicznych chromosomów, czy nawet z dwóch różnych organizmów. Jednym takim przykładem jest heteroduplexowe DNA tworzone w czasie hybrydyzacji materiałów genetycznych organizmów w celu ustalenia ich pokrewieństwa czy pochodzenia ( badania filogenetyczne).

3 Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:(w kompleksie synaptonemalnym podczas koniugacji poprzedzającej mejotyczny crossing-over )

4 Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:
Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji umożliwiają wymianę genów, a przez to także naprawę uszkodzonych jednostek .

5 Zastosowania badania filogenetyczne
analizy epidemiologiczne, np odnośnie Cryptosporidium wyizolowanych od ludzi i zwierząt badania screeningowe dotyczące wielu groźnych wirusów: HIV-1, WZW typu C, enterowirusów, w celu identyfikacji ich podtypów wykrywanie mutacji głównie punktowych i chorób genetycznych z nimi związanych (można analizować tylko krótkie odcinki kwasów nukleinowych, bo przeważnie na wstępie stosuje się PCR, nie wykryjemy tą metodą mutacji chromosomowych i genomowych).

6 Podstawowe założenie:
Nici DNA tworzące Heteroduplexy różnią się od siebie pewnymi sekwencjami i nie tworzą tak stabilnych układów jak homoduplexy, czyli molekuły dwuniciowego DNA komplementarne do siebie.

7 Chcąc wykryć w mieszaninie, po reakcji PCR, Heteroduplexy (odróżnić je od homoduplexów) możemy posłużyć się się metodami: DGGE- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)- elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym, która jest najdokładniejsza- ma 95 % skuteczność, ale i najdroższa mismatch cleavage (rozłupywanie się niedopasowań) DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)- Szybka chromatografia w roztworze denaturującym

8 Opis DHPLC przy wykrywaniu mutacji Szybka chromatografia w roztworze denaturującym

9 DHPLC mieszanina po reakcji PCR zawierająca DNA wzorca- niezmutowane i DNA organizmu badanego- potencjalnie obarczone mutacją) Denaturacja (podgrzanie) Renaturacja (ochłodzenie) tworzą się homo- i heteroduplexy

10 DHPLC Rozdział Hetero- od Homoduplexów jest osiągany poprzez działanie częściowo denaturujących czynników (temp. 57 °C) Rejestrowane są mikronapięcia towarzyszące przechodzeniu przez urządzenie cząsteczek DNA

11 DHPLC DNA jednoniciowe będzie pochodziło z heteroduplexów i jeżeli zostanie wykryte przez detektor w odpowiednio wysokim stężeniu, będzie to świadczyło o mutacji w obrębie DNA badanego Jeśli DNA organizmu badanego będzie homozygotą pod wzlędem mutacji, to otrzymamy największy udział Heteroduplexów w mieszaninie po PCR, a stężenie nici pojedynczych wykrytych podczas DHPLC będzie wysokie, W przypadku heterozygotyczności pod względem mutacji DNA badanego otrzymamy mniejsze stężenie pojedynczych nici i dlatego dobrze jest wtedy powtórzyć DHPLC bez obecności wzorca-nie jest ona wymagana, bo DNA badane jest Heteroduplexem brak mutacji-brak heteroduplexów.

12 Wynik DHPLC DHPLC detection of mutation in the Fanconi anemia gene, exon-4 in Ashkenazi population.

13 Źródła informacji: NCBI Wikipedia