Dichroizm kołowy.

Prezentacja na temat: "Dichroizm kołowy."— Zapis prezentacji:

1 Dichroizm kołowy

2 PODSTAWY Zjawisko dichroizmu kołowego (CD) jest rodzajem spektroskopii absorpcyjnej pozwalającej na mierzenie różnic w absorpcji światła lewoskrętnie i prawoskrętnie spolaryzowanego kołowo.

3 Jeśli wektor elektryczny oscyluje wzdłuż jednej linii, wówczas takie fale
elektromagnetyczne nazywamy spolaryzowanymi liniowo.

4 Kiedy dwie fale spolaryzowane liniowo w dwóch
różnych płaszczyznach, skierowane w tym samym kierunku, różnią się od siebie fazą mamy do czynienia wówczas z polaryzacją kołową

5 Superpozycja dwóch fal o tych samych amplitudach, prostopadłych do siebie,
różniące się od siebie fazą (+90o, - 90o)

6 Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym

7 Próka optycznie nieaktywna
Próka optycznie aktywna

8 Światło spolaryzowane
[OR] [q] (mdeg) – obserwowana eliptyczność

9 Kołowo spolaryzowane fale w medium absorbującym o właściwościach
optycznych

10 Cetonia aurata Światło lewoskrętnie spolaryzowane

11 Chiloloba acuta

12

13 Świetlikowate, robaczki świętojańskie (Lampyridae)

14

15 Całkowite wewnętrzne odbicie

16 ABSORBCJA ŚWIATŁA Dla roztworu o A = 1 DA = 10-4 – 10-6
Światło prawoskrętnie spolaryzowanle Światło niespolaryzowanle Światło lewoskrętnie spolaryzowanle Dla roztworu o A = 1 DA = 10-4 – 10-6

17 ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA [] (deg*cm2*decimol-1) – eliptyczność molowa
l (cm) – długość ścieżki optycznej c (mol/dm3) – stężenie substancji [] (mdeg) – eliptyczność

18 ŚREDNIA ELIPTYCZNOŚĆ MOLOWA NA
RESZTĘ AMINOKWASOWĄ n – ilość aminokwasów w białku

19 Przejścia w obrębie grup amidowych:
n* (~220nm) o* (~200nm)

20 Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego n* (n*) (~220nm)
Elektryczny dipolowy moment przejścia amidowego o* ( o*) (~200nm)

21 Typowe widma struktur 2-rzędowych białek

22 Poli -Lys in 25oC: pH 10.8 () pH 11.1 (after 15min in 52oC) () pH 7.0 (r)

23 Widma Absorpcyjne oraz CD zredukowanego i utlenionego cytochromu c1

24

25

26

27

28

29 Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynianiowego w 0.1M NaF pH 7.0
dopasowane składowe  oraz  Sybtylizyna w 0.1M NaF pH 7.0

30

31

32

33

34 Model of doublecortin tandem
- - DCX DCX C C - - DCX DCX

35 Structure of the N-terminal domain of doublecortin
bbabbb a3 C-term a2 b5 b2 a1 b1 b4 b3

36  (deg  cm2  dmol-1) x 106  (nm)
Circular dichroism spectra of isolated domains and DCX-tandem of doublecortin  (deg  cm2  dmol-1) x 106 Tandem N-DCX C-DCX  (nm) Measurements were performed in 50 mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, protein concentration: 50M

37 Widmo CD N-DCX of doublecortin

38 Zależność stopnia sfałdowania białka od temperatury
0.1<Kden<10 0 D 100 100 N 0 Tden (Tm) temperature denaturant ½ [denaturant]

39 Krzywa denaturacyjna N-DCX
(25mM bufor fosforanowy, pH 6.0, DHden = 83.9 kcal/mol, Tden = oC. CD Temperature (oC)

40 Analiza krzywej denaturacyjnej
an+bn[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu natywnego au+bu[GdmHCl] - intensywność fluorescencji stanu zdenaturowanego m - zależność Gden od [GdmHCl] Gden - zmiana swobodnej entalpii denaturacji

41 Denaturacja termiczna FGF
Fraction unfolded Temperature (oC) Tm = 40.5 oC, DHvH = 68.9 kcal/mol Measurement was performed in 25mM phosphate pH 7.3, 0.7M GdmHCl, heating rate = 0.25 oC/min, protein conc.= 80 g/ml. The transition was monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

42 Denaturacja chemiczna FGF
Fraction unfolded DG = 5.53 kcal/mol Gdm½ = 1.13 M m = 4.8 kcal/mol M GdmHCl (M) Measurements were performed in 25mM phosphate pH 7.3, protein concentration = 25 g/ml. The transitions were monitored by the increase of fluorescence at 353nm on excitation at 280nm

43 Thermal unfolding transition of N-DCX and DCX-tandem of doublecortin
Measurements were performed in 25mM phosphate, 300mM NaCl, pH 7.0, heating rate = 1oC/min, protein conc.= 20 g/ml. Transitions were monitored by the changes of the CD signal at 220nm.

44 pH titration of N-DCX of doublecortin
8.0 7.0 5.9 5.0 4.0 3.0 2.0

45 pH titration of N-DCX of doublecortin

46 FGF-1 - Heparyna fibroblast growth factor Asn 18 Lys 112 Lys 113
Arg 119 Arg 122 Gln 127 Lys 128 PDB: 1axm

47 Widma CD mutantów FGF-1 Circular dichroism spectra of the wild-type of FGF-1 (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ), F108Y (□) and H21Y (●) mutants.

48 Denaturacja termiczna wariantów FGF-1
b Normalized thermal denaturation curves of the wild-type (○), V109I (■), H102Y (▲), L44F (Δ), F108Y (□), H21Y (●) mutants monitored by changes of fluorescence (a) or ellipticity (b).

49 Parametry denaturacji chemicznej mutantów FGF-1 w obecności heparyny
Thermal induced unfolding were performed in 25mM phosphate, 1.5M Urea, pH 7.3, scan rate oC/min. 10x molar excess of heparin were used. The transitions were monitored by the residual ellipticity at 227 nm Mutant Tm DH Tm DH (oC) (kcal/mol) (oC) (kcal/mol) WT V109I F108Y H102Y H21Y L44F

50 Struktura trzeciorzędowa białek

51