Dr Stanisława Koronkiewicz

Prezentacja na temat: "Dr Stanisława Koronkiewicz"— Zapis prezentacji:

1 Dr Stanisława Koronkiewicz
Bio- i chemiluminescencja Od robaczków świętojańskich do laboratoriów XXI wieku Olsztyn, 3.III.2006.

2 Luminescencja – „zimne świecenie”
Świecenie ciał wywołane innymi czynnikami niż podniesienie temperatury źródła promieniowania Rys. Podział zjawisk luminescencyjnych w zależności od czynnika wzbudzającego, który podano w nawiasach.

3 Chemiluminescencja – emisja promieniowania widzialnego towarzysząca reakcjom chemicznym przebiegającym w temperaturze pokojowej, w której nie należałoby normalnie oczekiwać świecenia. Energia reakcji chemicznych, która jest zazwyczaj wydzielana w postaci ciepła, w nielicznych przypadkach jest zużywana na wzbudzenie układu elektronowego cząsteczek produktu reakcji i dalej może być wydzielana w postaci kwantu światła: S S2  P1* P2  P P2 + h S1, S2 – substraty reakcji, P1* - produkt reakcji w stanie wzbudzonym, P2 – produkt reakcji w stanie podstawowym, h - kwant emitowanego światła. Wydajność kwantowa chemiluminescencji jest równa 1 (czyli 100 %), gdy zajściu jednego aktu reakcji chemicznej towarzyszy emisja jednego kwantu światła.

4 Chemiluminescencja przebiegająca w organizmach żywych jest nazywana bioluminescencją
Bioluminescencja bakterii jest przyczyna tzw. Fosforescencji morza w strefie podzwrotnikowej.

5 Bioluminescencja Chrząszcze- enzymatyczne utlenianie lucyferyny katalizowane lucyferazą Bakterie- enzymatyczne utlenianie prostych aldehydów alifatycznych. W reakcji bierze udział flawinomononukleotyd (FMNH2) oraz ATP. Wydajność kwantowa bioluminescencji – kilkadziesiąt % !!!

6 Chemiluminescencja Najwydajniejsze reakcje chemiluminescencji:
Wydajność kwantowa intensywnej chemiluminescencji: od 1do 30% (Lee 1997) Najwydajniejsze reakcje chemiluminescencji: 1. świecenie luminolu w rozpuszczalnikach organicznych (DMSO), 2. utlenianie lucygeniny, 3. utlenianie dwukrzemku wapnia CaSi2, 4. utlenianie szczawianów organicznych w obecności przenośników energii.

7 Doświadczenie: Do kolby stożkowej o pojemności 750 ml wsypujemy 50 g stałego KOH i wlewamy 20 ml dwumetylosulfotlenku ( (CH3)2SO – DMSO ), a następnie dodajemy ok. 10 mg stałego luminolu. Zawartość kolby intensywnie wstrząsamy. Po 2 – 3 minutach rozpoczyna się emisja światła. Jasność świecenia jest tak duża, że pozwala na czytanie druku w ciemności. Czas świecenia wynosi ok. 30 minut. Zwiększenie ilości luminolu pogarsza emisję światła, natomiast wstępne napełnienie kolby tlenem podwyższa jaskrawość świecenia. Doświadczenie to można przeprowadzić także stosując zamiast KOH NaOH oraz dwumetyloformamidu (HCON(CH3)2 – DMF ) zamiast dwumetylosulfotlenku, jednak daje to nieco gorszy wynik. LUMINOL pKa1=6.00 pKa2=13.00 Informacje na temat luminescencji luminolu można znaleźć: T.Pluciński. "Doświadczenia chemiczne" . Wyd. “Adamantan”, Warszawa 1997.

8 Chemiluminescencja luminolu
związana jest z utlenianiem luminolu z środowisku alkalicznym w obecności aktywatorów Warunki reakcji: środowisko alkaliczne, obecność utleniacza (np. woda utleniona, ClO-, anoda elektrolizera), obecność aktywatora (np. jony Fe(III), Cu(II)), Cr(III)... ) W roztworze wodnym wydajność kwantowa świecenia nie przekracza 0,1%. W niektórych polarnych rozpuszczalnikach organicznych (DMSO, DMF), wydajność kwantowa może być nawet 10 razy większa. Może zachodzić pod wpływem tlenu powietrza, bez obecności aktywatora.

9 Reakcję luminescencji luminolu można wykorzystać do oznaczania:
różnego rodzaju utleniaczy (oznaczenia bezpośrednie), substancji, które w reakcjach chemicznych jako jeden z produktów dają utleniacz, np. nadtlenek wodoru. Wykorzystuje się to m.in. w oznaczeniach glukozy z wykorzystaniem oksydazy glukozowej (oznaczenia pośrednie). aktywatorów: jonów metali, np.: Co(II), Fe(III), Cu(II)), Cr(III)...

10 Substancje nieorganiczne Substancje organiczne
Przykłady oznaczeń chemiluminescencyjnych Analit Rodzaj reakcji chemiluminescencyjnej Matryca próbki Limit detekcji Literatura Substancje nieorganiczne Cr(III) Luminol – H2O2 Próbki żywności; woda destylowana, pitna, mineralna 0.01 ppb ESCOBAR i inni 1993 Fe(III) Luminol – wodny roztwór amoniaku - H2O2 Woda morska 0.003 ppb OBATA i inni 1993 H2O2 Luminol z sensybilizatorem (eozyna Y-uranina) Woda kranowa 3,410-7 ppb ISHII i SHIRAI 1992 CN- Czujnik wykorzystujący luminol unieruchomiony na wypełnieniu anionowymiennej kolumny Ścieki przemysłowe 1 ppb LU i inni 1995 NO2- Redukcja do NO; chemiluminescencja w fazie gazowej w reakcji z ozonem Ekstrakty żywności, ludzka ślina 0.04 ppb DUNHAM i inni 1095 Substancje organiczne etanol Enzymatyczna produkcja H2O2; reakcja luminolu z haksacyjanożelazianem(III) potasu wino 10-6 mol/l XIE i inni 1992

11 Problemy z chemiluminescencją:
1. Brak selektywności 2. Zależność sygnału od takich czynników jak: temperatura, rodzaj rozpuszczalnika, siła jonowa roztworu i jego pH. Polepszanie selektywności: Połączenie CL z jakąś techniką rozdziału (np. HPLC, elektroforeza kapilarna), Zastosowanie reakcji elektrochemicznych Wykorzystanie reakcji enzymatycznych lub immunologicznych (oznaczenia pośrednie)

12 Biosensory enzymatyczne
Dlaczego? Bardzo duża selektywność reakcji przebiegających w organizmach żywych (reakcje enzymatyczne, reakcje immunologiczne) Jak? Nadtlenek wodoru powstający w wysokospecyficznej reakcji enzymatycznej jest poddawany czułej detekcji chemiluminescencyjnej. Detekcja enzymatycznie produkowanego nadtlenku wodoru w reakcji z luminolem. Nadtlenek wodoru powstaje w wysokospecyficznej reakcji enzymatycznej i jest poddawany czułej detekcji chemiluminescencyjnej.

13 Pomiar natężenia chemiluminescencyjnych można wykorzystać jako metodę detekcji w:
wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), elektroforezie kapilarnej (CE), technikach przepływowych (FIA, przepływowa analiza multikomutacyjna lub sekwencyjna). Metody te wymagają unieruchomienia jednego z substratów reakcji. Można to zrobić wykorzystują w tym celu np. kolumny jonowymienne lub adsorbując odpowiednie substancje na powierzchni biosensora. Czujniki enzymatyczne: (Kalinowski 2004) Jednym ze sposobów unieruchomienia różnego rodzaju enzymów na powierzchni metalu jest wykorzystanie kompleksów biotyny (witaminy H) z awidyną lub streptawidyną. W handlu jest dostępnych wiele biotynylowanych substancji, np. enzymy, lipidy, znaczniki fluorescencyjne, DNA, RNA… Biotynylowane cząsteczki można łatwo adsorbować na powierzchniach pokrytych awidyną lub streptawidyną.

14 Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu
Biotyna (witamina H, witamina B7) Awidyna, Streptawidyna – białka silnie wiążące się z biotyną Biotynylowane fosfolipidy

15 Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów
a- awidyna osadzona na stałym hydrofobowym podłożu, b- awidyna połączona z podłożem za pomocą biotyny, c- na Au osadzona warstwa merkaptanu, na tym monowarstwa fosfolipidowa zawierająca biotynylowane fosfolipidy

16 FIA z detekcją chemiluminescencyjną
Automatyzacja analiz FIA z detekcją chemiluminescencyjną Jedna z najbardziej uniwersalnych i prostych metod automatyzacji analiz chemicznych Charakteryzuje się dobrą precyzją i szybkością odpowiedzi Pozwala na znaczne zmniejszenie zużycia odczynników Typowy system do FIA (flow inhjection analysis) jest łatwy w obsłudze PP- pompa perystaltyczna, ZW- zawór wstrzykowy, S- spirala (reakcyjna lub emisyjna, PMT- fotopowielacz, A-miernik fotoprądu

17 Przepływowa amaliza multikomutacyjna
MCFA – multicommutation flow analysis Technika automatyzacji analizy przepływowej opierająca się na zastosowaniu najczęściej trójdrożnych zaworów elektromagnetycznych sprzężonych ze sobą w sieć odpowiednio zaprojektowanych połączeń. Trójdrożne zawory elektromagnetyczne mogą pozostawać w dwóch pozycjach umożliwiających przepływ cieczy w dwóch różnych kierunkach. Elektroniczna kontrola czasu trwania impulsu przełączającego zawór pozwala na uzyskanie bardzo powtarzalnych wyników, przy objętościach próbek rzędu mikrolitrów. Dzięki multikomutacyjnemu mieszaniu reagentów uniknąć można nadmiernego zużycia odczynników.

18 Zestaw do multikomutacyjnej analizy przepływowej z detekcją chemiluminescencyjną
V1, V2 – trójdrożne zawory elektromagnetyczne P-pompa perystaltyczna, FC-naczynko przepływowe do pomiarów luminescencji, PMT-fotopowielacz, KSP-zestaw pomiarowy firmy KSP, PC-komputer.

19 Zestaw do przepływowej analizy multikomutacyjnej pracujący w
Katedrze Chemii UWM

20 Rys. Okno edycyjne programu stosowanego do sterowania pompą perystaltyczną i zaworami elektromagnetyczne oraz do rejestracji natężenia fotoprądu chemiluminescencji.

21 Przykłady komercyjnych zastosowań chemiluminescencji
Chemiczne oświetlacze "Cyalume„ Zastosowanie: ratownictwo, speleologia, turystyka, policja, wojsko. Chemiczna latarka jest odporna na stłuczenie, czy zalanie woda, ale nie da się jej wyłączyć… Źródło światła: Reakcja utleniania szczawianów organicznych rozcieńczonym roztworem bezwodnego nadtlenku wodoru w mieszaninie ftalanu metylu i alkoholu tert-butylowego, katalizowana salicylanem sodu. Czas świecenia takiej latarki wonosi od 5 min do 12 godzin.

22

23 Literatura Lee Won-Yong, (1997) Tris (2,2’-bipyridyl)rutenium(II) electrogenerated chemiluminescence in analytical science. Microchim. Acta, 127, Fahnrich, K.A., Pravda M., Guilbault G.G., (2001) Recent applications of electrogenated Chemiluminescence in chemical analysis. Talanta, 54, Roda A., pasini P., Mirasoli M., Michelini E., Guardigli M., (2004) Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence. Trends Biotechnol., 22, Kalinowski S., „Elektrochemia membran lipidowych. Od błon komórkowych do biosensorów”. Wydawnictwo UWM, Olsztyn 2004. T.Pluciński. "Doświadczenia chemiczne" . Wyd. “Adamantan”, Warszawa 1997.