Aleksander Kołodziejczyk

Prezentacja na temat: "Aleksander Kołodziejczyk"— Zapis prezentacji:

1 Aleksander Kołodziejczyk
Peptydy Gdańsk 2013

2 Peptydy są to produkty acylowania aminokwasów aminokwasami
Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami

3 W zależności od oddalenia od Ca grup funkcyjnych tworzących wiązanie peptydowe mogą to być wiązania a- , b- , g- i inne. Wiązania a-peptydowe powstają pomiędzy grupą a-karboksylową i a-aminową. Nomenklatura peptydów waliloalanylocysteinyloglicylo-g-glutamylo-Ne-lizyloseryloglicyna Val-Ala-Cys-Gly-g-Glu-Ne-Lys-Ser-Gly symbole trójliterowe N-terminalny C-terminalny VACG-g-E-e-KSG symbole jednoliterowe

4 Val-Ala-Gly H-Val-Ala-Gly-OH cyklopeptydy cyklo(-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro-) Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro

5 Nagrody Nobla za osiągnięcia związane z peptydami
1902 Emil Fischer badanie cukrów, synteza pierwszych peptydów 1923 Frederick Banting odkrycie insuliny John Maclead 1952 Archer Martin opracowanie chromatografii peptydów, Richard Synge ustalenie budowy gramicydyny 1955 Vincent du Vigneaud otrzymanie oksytocyny i wazopresyny, pierwszych biologicznie czynnych peptydów 1958 Frederick Sanger ustalenie przestrzennej budowy insuliny Dorothy Hodgkin 1972 Christian Anfinsen ustalenie budowy i wyjaśnienie działania Stanford Moor rybonuleazy, William Stein konstruktorzy analizatora aminokwasów 1977 Roger Guillemin badanie hormonów mózgowych Andrew Schally Rosalyn Yalow 1980 Walter Gibert badanie struktury białek i peptydów Frederick Sanger 1984 Robert Merrifield synteza peptydów na fazie stałej

6 Peptydy wytwarzane przemysłowo

7 Chemiczna synteza peptydów

8 Dobra osłona peptydowa powinna:
- być łatwa do wprowadzania; - być trwała w takcie syntezy peptydu i jego oczyszczaniu; - zapewniać dobrą rozpuszczalność chronionego AA; - ułatwiać reakcję tworzenia wiązania peptydowego; - utrudniać reakcje uboczne, w tym racemizację; zapewniać możliwość selektywnego lub/i równoczesnego usuwania wszystkich osłon; - być w 100% łatwo usuwalna Syntetyczna rybonukleaza A, w której usunięto 83% osłon miała jedynie 70% aktywności biologicznej białka natywnego.

9

10 Boc Osłony grupy aminowej t-butyloksykarbonyl
uretan – pochodna kwasu węglowego:

11 Osłony grupy karboksylowej (głównie estry):
Osłony grupy hydroksylowej: benzyl, t-butyl; acetyl (Ac-); trimetylosilyl – (CH3)3Si- Osłony grupy tiolowej: benzyl; acetamidometyl (AcNH-CH2-); t-butyl Osłony grupy imidazolowej: benzyl; t-butoksyl; formyl; benzyloksymetyl (Bom- – Bzl-O-CH2); - tosyl; Fmoc Osłony grupy guanidynowej: nitro (-NO2); tosyl, p-metoksybenzenosulfonyl (Mbs-); benzyloksykarbonyl

12 METODY TWORZENIA WIĄZANIA PEPTYDOWEGO
Metoda kardodiimidowa (DCC) peptyd częściowo zracemizowany

13 ester aktywny Produkt uboczny N-acylomocznik

14 Reakcja z udziałem soli estru
Wydajność reakcji = wydajność Ac-Phe-Leu-OMe: 54% Stopień racemizacji E = 11% Reakcja z udziałem soli estru Metoda DCC z dodatkami obniżającymi racemizację

15 mieszany bezwodnik Metoda mieszanych bezwodników
chloromrówczan s-butylu Metoda aktywnych estrów Aktywne estry: p-nitrofenylowe; pentafluorofenylowe; -OBt; ONSu Metoda EEDQ N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolina

16 heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksy- fosfoniowy
Metoda BOP heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksy- fosfoniowy tris(dimetylo)fosforotriamid jest kancerogenny. Niekancerogenne odczynniki kondensujące. heksafluorofosforan tris(pirolidyno)- -1-benzotriazoliloksyfosfoniowy tetrafluoroboran [2-(1-benzotriazolo)]- -1,1,3,3-tetrametylouroniowy heksafluorofosforan bromo- tris(pirolidyno)fosfoniowy

17 Metoda azydkowa Metoda azydkowa ma obecnie jedynie historyczne znaczenie. Dawniej uważana za „bezracemizacyjną” była stosowana do łączenia fragmentów peptydów. Inne metody łączenia fragmentów dawały produkty mocno zracemizowane. W metodzie azydkowej stopień racemizacji osiąga wielkość kilku procent. Racemizacji ulega aminokwas acylujący Stopień racemizacji zależy zarówno od metody stosowanej do utworzenia wiązania peptydowego, jak i właściwości komponentu acylującego; istotną rolę pełni rodzaj osłony grupy aminowej. Osłony uretanowe (Z, Boc, Fmoc) są bezracemizacyjne, tzn. podczas reakcji tworzenia wiązania peptydowego ulegają racemizacji w stopniu poniżej 0,1%.

18 AA zawierające osłony acylowe (Ac, Bz, CHO, Pht), a także AA acylowane innym aminokwasem (peptydem) racemizują znacznie podczas acylowania (aktywacji). Stopień racemizacji zależy również od wzajemnej konfiguracji aminokwasów tworzących wiązanie peptydowe. Zależność stopnia racemizacji E od konfiguracji reagentów Reakcja E Z-Leu Leu-OMe <0,1 Ac-Leu Leu-OMe 40 Ac-D-Leu Leu-OMe  13 Ac-Leu Phe-OMe 35 Ac-D-Leu Phe-OMe  21 CHO-Leu Leu-OMe 5 CHO-D-Leu Leu-OMe   4 Z-Gly-Leu Leu-OMe 34 Z-Gly-D-Leu + Leu-OMe 70

19 Stopień racemizacji jest zależny nie tylko od właściwości reagujących komponentów aminokwasowych i rodzaju aktywacji, ale również od warunków reakcji, czyli rozpuszczalnika, temperatury i czasu reakcji. Synteza peptydów i białek w komórkach jest w 100% bezracemizacyjna.

20 Synteza peptydów na fazie stałej
Synteza w roztworze nazywana jest syntezą klasyczną. W 1963 r. B. Merrifield zaproponował nową metodę syntezy peptydów, została ona nazwana syntezą na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis. Synteza na nośniku stałym - SPPS P = polistyren sieciowany diwinylobenzenem N = nośnik

21 Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w
postaci kuleczek o średnicy ziarna mm Ziarna są porowate i zawierają wiele kanalików. W tych kanalikach rosną łańcuchy syntezowanych peptydów. W ziarnie o średnicy 50 mm obsadzonym 0,3 mmola peptydu na 1 g żywicy znajduje się 1012 łańcuchów peptydowych. Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy. Kanaliki muszą mieć odpowiednią średnicę, żeby pomieścić łańcuchy rosnącego peptydu. Przed rozpoczęciem syntezy polimer jest traktowany rozpuszczalnikiem, w którym pęcznieje powiększając rozmiary porów. Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając dziewięcio-krotnie swoją objętość.

22 Zwykle poszczególne operacje na żywicy przeprowadza się w różnych rozpuszczalnikach. Zmianę rozpuszczalnika należy przeprowadzać stopniowo. Synteza peptydu na fazie stałej to operacje jednostkowe powtarzające się cyklicznie.

23 Operacje jednostkowe liczba czas [min]
A. Przemywanie – przygotowanie do deprotekcji 1. EtOH/AcOH, 1: 2. AcOH B. Deprotekcja 3. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 4. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH A. Przemywanie – przygotowanie do neutralizacji 5. AcOH 6. AcOH/EtOH, 1: 7. EtOH 8. EtOH/DCM, 1: 9. DCM D. Neutralizacja 10. NEt3/DCM 11. NEt3/DCM

24 Procedura zależy od stosowanych osłon, odczynników sprzęgających,
E. Przemywanie – przygotowanie do acylowania 12. DCM F. Acylowanie (ang. coupling) 13. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 14. Przemywanie DCM 15. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM G. Przemywanie – przygotowanie do testu Kaisera 16. DCM 17. DCM/EtOH, 1: 18. EtOH H. Test Kaisera 19. Sprawdzenie stopnia acylowania Procedura zależy od stosowanych osłon, odczynników sprzęgających, a także od właściwości fizykochemicznych stosowanego nośnika. Nośnik może przypominać peptyd, np. żywica poliamidowa Scheparda W syntezie peptydów na żywicy Scheparda stosuje się osłony Fmoc. Usuwa się je w środowisku zasadowym. Po zakończeniu syntezy peptyd zdejmuje się z nośnika.

25 Początkowo największym problemem SPPS była niska czystość peptydu,
spowodowana niższą niż 100% wydajnością poszczególnych etapów reakcji, nie tylko acylowania, ale i deprotekcji i neutralizacji. Wydajność poszczególnych etapów reakcji udało się zwiększyć prawie do 100% poprzez stosowanie nadmiaru reagentów, a w razie potrzeby powtarzania etapu. Nadmiar odczynników w metodzie SPPS nie stanowi problemu, ponieważ łatwo je usunąć poprzez odsączenie i przemycie żywicy. Zwykle cena syntezowanego peptydu jest tak wysoka, że koszty nadmiarowych odczynników nie są brane pod uwagę.

26 Peptydy błędne

27 Skład produktu końcowego w syntezie peptydów metoda SPPS
Frakcja Średnia wydajność poszczególnych etapów syntezy [%] 90 98 99 99,5 99,9 Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy oksytocyny (9-peptydu) 9-peptyd 43 85 92 96 99 8-peptydy 38 14 8 4 1 7-peptydy 15 1 0,3 Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy rybonukleazy (124-peptydu) 124-peptyd 8 29 54 88 123-peptydy 21 36 33 11 122-peptydy 26 22 10 1

28 Syntezy enzymatyczne

29 CT: a-chymotrypsyna t-PenOH: t-pentanol HO-PEG-OMe: monometylowy eter poli(glikolu etylenowego) CT-O-PEG-OMe: CT kowalencyjnie związana z HO-PEG-OMe

30 Wybrane przykłady zastosowania CT-O-PEG-OMe do syntezy peptydów
Składnik acylujący acylowany Czas reakcji [h] Wydajność peptydu Stopień hy- drolizy % Z-PheOEt LeuNH2 36 40 8 Z-PheOEt LeuNH2 96 78 22 Z-Phe-OCH2CF3 LeuNH2 36 90 10 Z-Phe-OCH2CF3 Leu-OMe 96 8 15 Z-Phe-OCH2CF3 D-Leu-OMe 48 63 14 Boc-D-Phe-Tyr-Cam LeuNH2 96 15 4 Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-NHCH3 LeuNH2 48 70 17

31 Synteza LH-RH dekapeptyd hormonu uwalniającego hormon luteinizujący
luteinizing hormon releasing hormon pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 dekapeptyd pEHWSYGLRPGNH2 pEHWSY-OMe GLRPGNH2 0,10M 0,12M LH-RH pEHWSYGLRPGNH2 95%

32 T: trypsyna CT: chymotrypsyna P: papaina CPD-Y: karbopeptydaza Y CLP: klostrypaina PPSE: specyficzna endoproteaza postprolinowa

33 Synteza aspartanu – słodkiego peptydu
Polisynteza Ze względu na duże zapotrzebowanie na peptydy skonstruowano syntezatory peptydów umożliwiające równoczesną syntezę kilkudzie-sięciu, a nawet kilkuset różnych peptydów. Takie operacje prowadzi się np. na prętach pokrytych glikolem polietylenowym lub innym polimerem zdolnym do przyłączenia C-końcowego aminokwasu. Pręty osadzone są w gniazdach bloku, a każde gniazdo zaopatrzone jest w system doprowadzający roztwory odczynników. Wypróbowano też syntezę peptydów w pojemniczkach podobnych do woreczków z herbatą ekspresową; takie woreczki można było w zależności od potrzeb umieszczać w różnych reaktorach.

34 Tym sposobem wyselekcjonowano heksapeptyd: Ac-RRWWCRNH2
Synteza kombinatoryczna – biblioteki peptydów Tym sposobem wyselekcjonowano heksapeptyd: Ac-RRWWCRNH2 o bardzo wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej z pośród mieszaniny zawierającej