Modelarstwo – niezwykłe hobby krystalografów

Prezentacja na temat: "Modelarstwo – niezwykłe hobby krystalografów"— Zapis prezentacji:

1 Modelarstwo – niezwykłe hobby krystalografów
Koło Naukowe Biologii Molekularnej – Marek Kudła

2 Copyrights Obrazy i slajdy oznaczone gwiazdką zostały zaczerpnięte ze strony: Obrazy struktur zostały wygenerowane przy pomocy programu „O” Obrazy oznaczone # zostały wygenerowane przy pomocy Auto Dep Input Tool Rysunki oznaczone % zaczerpnięto z

3 Otrzymywanie mapy gęstości elektronowej

4 * * * * * *

5 Metodologia rentgenowskiej krystalografii strukturalnej opiera się na zdolności promieniowania elektromagnetycznego do ulegania dyfrakcji. W typowym eksperymencie intensywna wiązka promieniowania rentgenowskiego o długości 1.54 angstroema ulega dyfrakcji na krysztale białka, który można potraktować jako rodzaj trójwymiarowej siatki dyfrakcyjnej. Intensywności wiązek, które w wyniku dyfrakcji uległy odchyleniu od osi padania głównej wiązki rejestruje się przy pomocy specjalnego detektora. Dodatkowo kryształ obraca się wokół osi o ułamki stopni, po to aby odtworzyć rozmieszczenie wektorów wiązek w przestrzeni trójwymiarowej. W ten sposób otrzymujemy informacje o intensywności oraz położeniu wiązek tzw. structure factors. Jedynej informacji, której nam brakuje, a której jak na razie nie potrafimy mierzyć jest informacja o fazach w jakich dociera fala do detektora, która jak się niestety okazuje zawiera większość informacji potrzebnej do odtworzenia rozkładu gęstości elektronowej.

6

7 Typowy obraz z detektora rejestrującego
Typowy obraz z detektora rejestrującego. Biała plama na środku pochodzi od miedzianego walca, który powstrzymuje najintensywniejszą wiązkę promieniowania, pochodzącą bezpośrednio od maszyny, co zapobiega uszkodzeniu detektora. --- Istnieją różne metody uzupełnienia informacji o fazach. Jeżeli na podstawie homologii sekwencji wiemy, że nasze białko prawdopodobnie będzie posiadało strukturę bardzo podobną do białka o znanej strukturze możemy na jego podstawie obliczyć fazy i zastosować je do czynników struktury (structure factors) pochodzących z białka, którego strukturę próbujemy ustalić. Oczywiście nie zawsze możemy to uczynić. Innym rozwiązaniem jest uzyskanie kryształu białka ze związanym kationem bądź kompleksem metalu ciężkiego. Różnice między obrazami dyfrakcyjnymi tych dwóch kryształów pozwolą nam uzyskać informację o fazach. Niekiedy jednak niezbędne jest otrzymanie dwóch pochodnych danego białka.

8 Informacja o fazach dla czynników struktury Mapa gęstości elektronowej Z modelu obliczamy fazy, które stosujemy do czynników struktury Mapa gęstości staje się lepsza, jednak dzieje się to kosztem tego, że końcowy model jest zdeterminowany tym jak będziemy budować model w kolejnych krokach

9 Jeżeli zastosujemy uzyskane fazy do wyliczenia mapy gęstości elektronowej, to otrzymaną surową mapę możemy ulepszyć, jeżeli dopasujemy do tej mapy z grubsza poprawny model i na jego podstawie wygenerujemy fazy, które ponownie zastosujemy do czynników struktury i wyliczymy mapę. W takim iteracyjnym postępowaniu kryje się jednak pułapka tego, że możemy popełnić podstawowy błąd przy budowie wstępnego modelu i w ten sposób pracować na coraz lepszych, lecz jednocześnie z gruntu błędnych mapach. Główne przesłanie wynikające z tego jest takie, że proces otrzymywania mapy gęstości elektronowej i poprawnego modelu z założenia nie jest deterministyczny i zawiera w sobie spory udział czynnika ludzkiego, co w przypadku złej jakości danych i niedoświadczonego budowniczego modeli zwiastuje kłopoty.

10 *

11 # # # Komórka elementarna (Unit cell)
Jednostka asymetryczna (Asymmetric Unit)

12 W komórce elementarnej może istnieć więcej niż jedna jednostka asymetryczna. Ponieważ dane uzyskane z eksperymentu dyfrakcyjnego opisują komórkę elementarną jesteśmy w stanie polepszyć jakość danych (mapy), jeżeli uśrednimy gęstość elektronową wszystkich jednostek asymetrycznych w jednostce elementarnej. Znalezienie operatora, który mapowałby dokładnie każdą z jednostek asymetrycznych na pozostałe nie jest jednak proste.

13 Rozdzielczość: 2.4 Å R free - maksymalnie 0.24
Jedyny wzór, którym Was dzisiaj nakarmię. R free jest miarą tego jak nasze structure factors (czynniki struktury?) obliczone na podstawie modelu, który zbudowaliśmy odbiegają od obserwowanych structure factors. Jest to więc również miara jakości naszego modelu. Istnieją jeszcze inne R, liczone w nieco inny sposób jednak R free jest liczone na podstawie zbioru czynników struktury, które nigdy nie są używane do tworzenia mapy, pełniąc rolę referencyjna. Chłopską regułą jest przyjmowanie modelu za poprawny, jeżeli jego R free nie przekracza x0.1 rozdzielczości np. Rozdzielczość: 2.4 Å R free - maksymalnie 0.24

14 Budowanie modeli

15 % % Kąt phi – pomiędzy NH, a CA Kąt psi – pomiędzy CA, a CO
Kąt omega – kąt wiązania peptydowego, generalnie 180 stopni lub (rzadko) 0 stopni % Struktury graniczne przedstawiające delokalizację elektronów w wiązaniu peptydowym.

16 455 75 4 85.2% 14.0% 0.7% 0.0% # # Z położeniem reszt aa na wykresie Ramachandrana można walczyć na różne sposoby, jednakże końcowy efekt jest najczęściej wynikiem kompromisu z tym na co pozwala mapa gęstości elektronowej.

17 # # Glicyna jest jedynym aminokwasem, który może przyjmować wartości kątów phi i psi zabronione dla pozostałych aminokwasów. Nie posiada ona węgla beta, z którego obecności w łańcuchach bocznych innych aminokwasów wynikają ograniczenia na dozwolone wartości phi i psi.

18 „O” – ono – program do modelowania białek
Jeżeli ktoś bawiłby się na poważniej w budowanie modeli, polecam: System wizualizacji obrazu stereograficznego CrystalEyes na stacji roboczej SGI Indigo 2 „O” – ono – program do modelowania białek CCP4, JACKAL – pakiety algorytmów krystalograficznych

19 * * Przy wysokiej rozdzielczości i dobrej informacji fazowej dopasowanie modelu do struktury jest tak trywialne, że potrafią to algorytmy zawarte w większości pakietów krystalograficznych. Powyżej rozdzielczości dwóch angstroemów i przy niskiej jakości informacji fazowej konieczne jest ręczne budowanie modelu

20 Duże hydrofobowe aminokwasy, takie jak W, F, Y mają najczęściej dobrze zdefiniowaną gęstość elektronową, co pozwala na ustalenie jakiemu aminokwasowi odpowiadają łańcuchy boczne w je go okolicy np. jeżeli w sekwencji białka jest tylko jedna sekwencja DGAWAWGGD, to te dwa W pozwalają na przyporządkowanie innym, często gorzej zdefiniowanym gęstościom elektronowym łańcuchów bocznych ich aminokwasów.

21 W tym wypadku część łańcucha nie ma gęstości elektronowej prawdopodobnie ze względu na jego dużą mobilność. Gęstość elektronową posiadają tylko najbardziej stałe fragmenty.

22 Cząsteczki rozpuszczalnika mogą zaburzyć obraz gęstości aminokwasu dając twory trudne w interpretacji (woda zaznaczona czerwonymi gwiazdkami

23 W tym przypadku najprawdopodobniej złej jakości informacja fazowa skutkuje w braku gęstości elektronowej dla tego obszaru

24 Ponieważ atomy wodoru mają za małą ilość elektronów, aby w znaczący sposób powodować dyfrakcję promieniowania nie udaje się ich zaobserwować na mapie gęstości elektonowej. To powoduje, że nie mamy informacji o tym, w której orientacji z przedstawionych powyżej powinniśmy ustawić histydynę. (Tu dodatkowo nie mamy też informacji o gęstości elektronowej dla tego łańcucha bocznego.)

25 Podobnie w przypadku asparaginy lub glutaminy.
W takim przypadku decydujące jest to w jakiej pozycji dana reszta wysyca więcej wiązań wodorowych i nie powoduje zawady sterycznej.