Katarzyna Polska Zakład Chemii Nieorganicznej Wydział Chemii UMCS

Prezentacja na temat: "Katarzyna Polska Zakład Chemii Nieorganicznej Wydział Chemii UMCS"— Zapis prezentacji:

1 Tworzenie się związków kompleksowych pomiędzy konkanawaliną A i porfirynami
Katarzyna Polska Zakład Chemii Nieorganicznej Wydział Chemii UMCS Opiekun naukowy – prof. dr hab. Stanisław Radzki

2 Cel pracy: Celem pracy było zbadanie możliwości tworzenia się związków kompleksowych pomiędzy konkanawaliną A, białkiem wyizolowanym z nasion fasoli (Canavalia ensiformis) oraz rozpuszczalnymi w wodzie meso-podstawionymi porfirynami kationowym i anionowymi za pomocą metod spektroskopowych. Tworzenie się związków kompleksowych obserwowano w roztworach wodnych o różnym pH, określając różnice w trwałości powstających asocjatów, poprzez wyznaczenie stałych trwałości. Dodatkowym celem było również ustalenie stechiometrii tego typu związków asocjacyjnych.

3 Cel pracy: Badania poszerzono o analizę układów porfirynowo-białkowych w żelu krzemionkowym otrzymanym metodą zol-żel. Celem było uzyskanie transparentnych optycznie monolitów krzemionkowych domieszkowanych porfirynami, konkanawaliną A oraz asocjatami złożonymi z porfiryn i białka. Istotnym okazało się pytanie czy w monolicie krzemionkowym powstaną asocjaty porfiryn z konkanawaliną A oraz czy będą one stabilne.

4 Porfiryny Porfiryny są interesującymi związkami głównie ze względu na specyficzne właściwości spektroskopowe, magnetyczne, luminescencyjne oraz zdolność do fotoemisji i fotoprzewodnictwa. Fototoksyczne właściwości porfiryn wykorzystano w fotodynamicznej terapii nowotworów (PDT).

5 Terapia fotodynamiczna (PDT)
FOTONY PS* PS tlen singletowy niszczenie chorej tkanki

6 Terapia fotodynamiczna (PDT)
FOTONY PS* PS tlen singletowy Niszczenie nowotworu światłem lasera. Wcześniej pacjentowi podano barwnik, który wybiórczo gromadzi się w komór- kach rakowych. niszczenie chorej tkanki D. Frąckowiak, A. Dudkowiak, A. Ptak: Zdrowe niezdrowe słońce. Wiedza i życie 8 (2003)

7 Cel pracy wiąże się z zastosowaniem porfiryn jako fotosensybilizatorów w PDT.
Analiza połączeń tych fotosensybilizatorów z białkami może umożliwić lepsze zrozumienie mechanizmu ich lokowania się w guzach nowotworowych. Makromolekuły posiadające powinowactwo do komórek rakowych mogą ułatwić porfirynom przenikanie i kumulowanie się w nowotworach. Leki porfirynowe oparte na ich połączeniach z białkami są bardziej trwałe i bezpieczne dla organizmu.

8 Porfiryny kationowe H2TTMePP H2TMePyP
Cu Cu H2TTMePP H2TMePyP meso-tetrakis[4-(trimetyloamino) fenylo]-porfiryna meso-tetrakis[N-metylo- pirydylo]-porfiryna

9 Porfiryny anionowe H2TPPS H2TCPP meso-tetrakis[4-sulfoniano-
fenylo]-porfiryna meso-tetrakis[4-karboksy- fenylo]-porfiryna

10 Konkanawalina A Białko wyizolowane z fasoli (Canavalia Ensiformis) będące jednym z najlepiej zbadanych przedstawicieli grupy lektyn roślinnych. Ze względu na swe powinowactwo do cukrów oraz szeregu innych małych molekuł znalazło zastosowanie : w diagnostyce grup krwi, w badaniach nad stymulacją komórek odpornościowych, w chemioterapii jako czynnik przenoszący toksyny do komórek rakowych. Konformacja konkanawaliny A zależy od pH, w granicach pH występuje w postaci dimeru, a w pH powyżej 7 w postaci tetrameru i wyższych aglomeratów.

11 Konkanawalina A Struktura monomeru Cząsteczka tetrameryczna

12 Wyniki

13 Ewolucja widm absorpcji w zależności od pH

14 Ewolucja widm absorpcji w zależności od pH
K= 5,0·106 K= 5,7·103 K= 6,0·106 K= 7,4·103

15 Zależność zmian absorbancji porfiryny w paśmie Soreta podczas miareczkowania roztworem konkanawaliny A w układach o różnym pH oraz krzywe dopasowania teoretycznego (stechiometria 1:1).

16 Tab.1. Stałe trwałości asocjatów 1:1 konkanawaliny A z porfirynami
pH K [dcm3·mol-1] H2TTMePP 2,80 1,0·103 (3%) 8,70 4,3·105 (9%) 10,0 1,5·106 (8%) H2TMePyP 7,4·103 (4%) 5,0·105 (11%) 6,0·105 (7%) H2TPPS 3,3·105 (4%) 2,3· 105 (8%) 2,5· 104 (13%) H2TCPP 7,6· 10-1 (4%) 2,5· 105 (12%) 2,2· 105 (8%)

17 Tab.2. Stałe trwałości asocjatów 1:2 konkanawaliny A z porfirynami
pH K1,2 [dcm3·mol-1] CuTTMePP 2,80 K1 = 1,4·106 (9%) K2 = 8,2·104 (9%) 8,70 K1 = 6,3·106 (11%) K2 = 7,1·104 (11%) 10,0 K1 = 6,6·106 (6%) K2 = 2,1·104 (6%) CuTMePyP K1 = 1,0·106 (3%) K2 = 2,8· 107 (3%) K1 = 1,4· 106 (10%) K2 = 8,1· 106 (10%) K1 = 1,3· 106 (12%) K2 = 2,1· 107 (12%)

18 Fluorescencja

19 Fluorescencja

20 COSY 1H, 1H NMR H2TTMePP (2•10-3 M) Konkanawalina A (2•10-3 M) 2:1 1:1
1:2 11

21 Widma absorpcji w matrycach krzemionkowych
Widma emisji w matrycach krzemionkowych

22 Con A (CM = 1 x 10-4) Con A + H2TTMePP 1:1 (CM = 1 x 10-4)
Obrazy powierzchni dotowanego żelu krzemionkowego zarejestrowane za pomocą mikroskopu AFM. Wymiar skanowanych obszarów wynosi 5 x 5 μm.

23 Wnioski: Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono tworzenie się kompleksów pomiędzy konkanawaliną A oraz rozpuszczalnymi w wodzie porfirynami kationowymi i ich kompleksami z Cu(II), a także z porfirynami anionowymi. W powstających związkach na jeden monomer białka przypada jedna cząsteczka wolnej porfiryny (stechiometria 1:1) lub dwie cząsteczki porfiryny Cu(II) (stechiometria 2:1). Wyznaczone stałe trwałości badanych kompleksów świadczą o tym, że moc wzajemnych oddziaływań pomiędzy porfirynami i konkanawaliną A zależy od pH roztworu. W przypadku porfiryn kationowych wzrasta wraz ze wzrostem pH, natomiast w przypadku porfiryn anionowych maleje.

24 Taka zależność od pH może być atutem przy zastosowaniu badanej lektyny jako nośnika porfiryn w zorientowanym transporcie do komórek nowotworowych ze względu na to, że pH tkanki rakowej różni się od pH tkanek zdrowych. Pod wpływem konkanawaliny A intensywność fluorescencji porfiryn wzrasta, a maksima pasm wzbudzenia fluorescencji przesuwają się w stronę fal dłuższych. W obecności konkanawaliny A pojawia się fluorescencja miedziowych kompleksów porfiryn. Udało się uzyskać monolityczne żele immobilizowane porfirynami, konkanawaliną A oraz mieszaninami H2P/Con A. Żele te były transparentne optycznie i trwałe, a właściwości spektroskopowe zawartych w nich substancji nie wykazywały wyraźnych różnic w stosunku do właściwości w roztworach. W matrycach krzemionkowych potwierdzono tworzenie się związków o charakterze asocjacyjnym pomiędzy lektyną i porfirynami. Powstałe związki wykazywały dużą stabilność w czasie.

25 Proces tworzenia się kompleksu pomiędzy konkanawaliną A i porfiryną kationową w żelu krzemionkowym może być obserwowany bezpośrednio za pomocą zdjęć AFM. Otrzymane kserożele charakteryzują się intensywną czerwoną emisją w zakresie nm. Już to predestynuje je do zastosowania w charakterze czerwonych luminoforów. Układy te można otrzymać w postaci dowolnych kształtek mających właściwości podobne do szkieł. Mogą też, po rozkruszeniu i zmieleniu, pełnić rolę luminoforów proszkowych. Wnioski, jakie można było wysnuć na podstawie analizy widm układów Con A - H2P oraz obrazów uzyskanych metodą AFM pozwalają mieć nadzieję, że tego typu układy zamknięte w monolitach krzemionkowych znajdą kiedyś zastosowanie w badaniach nad modelami enzymów, systemami przenoszenia leków, biosensorami czy katalizatorami.

26 PODZIĘKOWANIA Badania wykonane w ramach niniejszej pracy
zostały częściowo sfinansowane ze środków Unii Europejskiej z Europejskiego Funduszu Społecznego w ramach Zintegrowanego Programu Operacyjnego Rozwoju Regionalnego. 10 11

27 Tworzenie się związków kompleksowych pomiędzy konkanawaliną A i porfirynami
Katarzyna Polska Zakład Chemii Nieorganicznej Wydział Chemii UMCS Opiekun naukowy – prof. dr hab. Stanisław Radzki