Projektowanie metabolizmu

Prezentacja na temat: "Projektowanie metabolizmu"— Zapis prezentacji:

1 Projektowanie metabolizmu
Otrzymywanie szczepów przemysłowych

2 Otrzymywanie wysokowydajnych producentów
metabolitów wtórnych o działaniu farmakologicznym

3 Cechy szczepu wysokowydajnego
maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe

4 Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych
nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów optymalizacja warunków wzrostu

5 Otrzymywanie wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych
Założenia: dobra znajomość szlaków metabolicznych i mechanizmów kontroli metabolizmu -konieczność wyeliminowania mechanizmów kontroli ograniczających poziom wytwarzania danego metabolitu -pożądane wyeliminowanie aktywności konkurencyjnych szlaków biosyntezy (w przypadku gdy dany metabolit nie jest końcowym produktem szlaku – konieczność zablokowania jego dalszych przemian) -pożądane wprowadzenie zmian struktury enzymu(ów) katalizujących przemiany kluczowe dla biosyntezy danego metabolitu, prowadzących do zwiększenia aktywności tego(tych) białek -niekiedy przydatne wprowadzenie zmian w transporcie komórkowym (pożądane efekty: zwiększenie szybkości dopływu substratów lub usuwania produktu)

6 Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania
wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE) Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego MUTANTY REGULATOROWE mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym powodująca stałą derepresję biosyntezy; mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość na działanie inhibitora allosterycznego

7 Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

8 Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

9 ULEPSZANIE SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH
·        Mutagenizacja ·        Hybrydyzacja szczepów ·        Technologia rekombinowanego DNA

10 Mutagenizacja szczepów
1 – mutacje pierwotne 2 – mechanizm naprawczy; odtworzenie stanu pierwotnego 3 – mechanizm naprawczy; mutacje wtórne 4 – śmierć komórki 5 – śmierć komórki 6 – namnażanie zmutowanych komórek Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy

11 Selekcja mutantów auksotroficznych
Metoda penicylinowa otrzymywania mutantów auksotroficznych bakterii

12 Selekcja mutantów auksotroficznych
Metoda replik z testem auksanograficznym 1,3 – płytki z podłożem kompleksowym; 2 – płytka z podłożem minimalnym

13 Selekcja mutantów regulatorowych
Metoda płytek gradientowych (Szybalskiego)

14 Hybrydyzacja

15 Hybrydyzacja Podstawa metody:
cykl paraseksualny grzybów  plasmogamia  komórki heterokariotyczne  kariogamia komórki diploidalne  możliwość wystąpienia mitotycznej rekombinacji genetycznej i w efekcie diploidalnych rekombinantów  segregacja materiału genetycznego i haploidyzacja  haploidalne rekombinanty

16 Hybrydyzacja – fuzja protoplastów
Główna przeszkoda w naturalnej plazmogamii – ściana komórkowa Protoplastyzacja komórek zasadniczo zwiększa częstotliwość Dodatkowe zalety protoplastyzacji: możliwość fuzji i rekombinacji pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym -możliwość rekombinacji międzygatunkowej -możliwość jednoczesnej rekombinacji kilku genotypów w jednym doświadczeniu -możliwość wymiany dużych fragmentów DNA -ułatwienie transformacji -możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi DNA -możliwość fuzji protoplastów komórkowych z organellami, np. mitochondriami Techniki fuzji -środowisko 30% PEG o masie – D, jony Ca(II), pH 9,0 -elektrofuzja – impulsy do 10 kV/cm (kilka ms) Po fuzji regeneracja ściany w środowisku stabilizowanym osmotycznie, selekcja

17 Hybrydyzacja – fuzja protoplastów
Metody otrzymywania protoplastów Zasada: enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej w warunkach zapewniających osmotyczną stabilizację powstających protoplastów Stabilizacja osmotyczna: sole nieorganiczne, np. MgSO4, cukry, np. sacharoza, zredukowane cukry, np. sorbitol, w stężeniach 0,5 – 1,5 M. Komórki bakteryjne: gramdodatnie – lizozym; gramujemne – lizozym + EDTA + SDS Komórki grzybowe: -glukuronidaza z Helix pomatia; chitynaza + -glukanaza (np. Zymolase)

18 Hybrydyzacja – fuzja protoplastów
Przykłady zastosowania: ·        Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów; ·        Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów kodujących wytwarzanie penicyliny G); ·        Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych. Rekombinant posiadał kombinacje cech korzystnych; wydajność o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.

19 Cel współczesnej i przyszłej biotechnologii
otrzymywania metabolitów wtórnych: Wytwarzanie złożonych substancji naturalnych, ich biokombinatorycznych (hybrydowych) pochodnych oraz zupełnie nowych substancji z wykorzystaniem całkowicie zaplanowanych procesów biosyntezy Modyfikacja enzymów przy pomocy inżynierii białek dająca w efekcie nowe spektra substratowe oraz nowe mechanizmy katalizy

20 STRATEGIE ZMIAN METABOLIZMU DROBNOUSTROJÓW
MAJĄCE NA CELU ZWIĘKSZENIE WYDAJNOŚCI BIOSYNTEZY METABOLITÓW WTÓRNYCH Amplifikacja genów biosyntezy całego szlaku lub jego części Zwiększenie odporności na antybiotyki w wyniku zmian w genach warunkujących odporność Zwiększenie wydzielania produktu poprzez zmiany w genach kodujących błonowe białka transportowe oraz białka regulujące systemy transportu Zmiany w genach kodujących białka regulatorowe (regulatory ogólne lub specyficzne dla szlaku) Celowe usunięcie etapów limitujących szybkość metabolizmu Wyłączenie genów, kodujących enzymy odpowiedzialne za biosyntezę niepożądanych produktów ubocznych Przeniesienie całego procesu biosyntezy do innego heterologicznego organizmu produkcyjnego

21 Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA do
otrzymywania wysokowydajnych szczepów wytwarzających antybiotyki