Drogi podawania biofarmaceutyków białkowych

Prezentacja na temat: "Drogi podawania biofarmaceutyków białkowych"— Zapis prezentacji:

1 Drogi podawania biofarmaceutyków białkowych
Produkcja sztucznych tkanek z zastosowaniem biopolimerów i systemów kontrolowanego uwalniania substancji

2 Porównanie cech farmakokinetycznych i farmakodynamicznych
leków białkowych i małocząsteczkowych Cecha Leki białkowe Leki małocząsteczkowe Masa cząsteczkowa Sposób podawania Obszar dystrybucji Wiązanie z białkami krwi Obecność w płynach ustrojowych pozakomórkowych Fagocytoza Eliminacja Eliminacja nerkowa Eliminacja wątrobowa Immunogenność >3000 Da Pozajelitowo (dożylnie, podskórnie, domięśniowo, wziewnie Głównie układ krwionośny Nieistotne Zależne od MW i hydrofobowości Istotne dla dużych białek (MW> 300 kDa) i agregatów białkowych Denaturacja, proteoliza Filtracja (MW< 50 kDa), metabolizm Fagocytoza, endocytoza, metabolizm Istotne dla podawanych wielokrotnie <1000 Da Wszystkie drogi Ograniczony hydrofobowością i wiązaniem z białkami ważne Biotransformacja, wiązanie z białkami Filtracja, transport, metabolizm Metabolizm Zwykle nieistotne

3 Problemy związane z podawaniem białek jako leków
stabilność preparatów przez podaniem stabilność podczas przechowywania stosunkowo krótkie czasy półtrwania po podaniu konieczność zabezpieczenia przed proteolizą, eliminacją nerkową i wątrobową sposób podawania immunogenność dotyczy białek innych niż ludzkie; rozwiązanie - koniugaty z polimerem rozpuszczalnym w wodzie

4 Stabilność preparatów białkowych
Czynniki i procesy wpływające na stabilność białek Czynniki fizyczne: temperatura, pH, adsorpcja powierzchniowa, niekowalencyjna agregacja i asocjacja Reakcje chemiczne: utlenianie tryptofanu, metioniny, cysteiny, histydyny, tyrozyny; Hydroliza wiązań peptydowych i amidowych; wymiana mostków disulfidowych Substancje pomocnicze stosowane do stabilizowania białek Substancja pomocnicza Funkcja Cukier (trehaloza, maltoza) Podwyższenie temperatury przejścia międzyfazowego Cukry zredukowane (sorbitol, mannitol) Środki powierzchniowo-czynne Zapobieganie adsorpcji powierzchniowej EDTA Zapobieganie utlenianiu cysteiny Polimery (dekstrany, kaboksymetyloceluloza) Zapobieganie agregacji niekowalencyjnej Aminokwasy (lizyna, arginina) Zwiększenie rozpuszczalności

5 Sposoby podawania leków białkowych
Droga pozajelitowa (93%) Doustnie dożylnie (iv) rzadko stosowane domięśniowo (im) tylko dla preparatów zmodyfikowanych podskórnie (sc) dootrzewnowo wziewnie (aerozole) – 3% Domiejscowo (4%) do oka do serca do rdzenia kręgowego transdermalnie (żele)

6 Sposoby podawania leków białkowych
Podawanie domięśniowe i podskórne Problem konieczności zapewnienia przedłużonego działania Producent Peptyd/białko Wskazanie Postać Alkermes/Genentch Alkermes/ Johnson&Johnson Takeda AstraZeneca Rekombinowany ludzki hormon wzrostu Erytropoetyna Octan leuproreliny Octan gosereliny Zaburzenia wzrostu Niedokrwistość Rak prostaty Mikrocząstki (ProLease) Mikrocząstki (PLA/PGLA) Implanty Polimery biokompatybilne, biodegradowalne, nieimmunogenne PLA – polimleczan PLGA – poli(D,L-mleczan-co-glikolan)

7 Sposoby podawania leków białkowych
Implantowana pompa osmotyczna Przed implantacją system napełnia się roztworem leku. W miejscu implantacji woda przenika przez błonę do komory osmotycznej. Ilość roztworu leku wydzielanego ze zbiornika odpowiada ilości wody wchodzącej do komory Taki system zapewnia stały poziom leku białkowego w osoczu

8 Sposoby podawania leków białkowych
Samoregulujący się system podawania insuliny

9 Sposoby podawania leków białkowych
Podawanie wziewne Forma leku: aerozol Drogi wnikania: nabłonek doprowadzających dróg oddechowych (tchawica, oskrzela, oskrzeliki) – 5% powierzchni nabłonka płuc Komórki nabłonka kolumnowego, warstwa 30 – 40 m, stosunkowo nieprzepuszczalne dla większych cząsteczek (>5 kDa). Możliwy transport na drodze dyfuzji okołokomórkowej, transcytozy lub z udziałem receptorów. Można osiągnąć zwiększenie przenikalności okołokomórkowej podając cytochalazynę lub poli-L-lizynę. nabłonek pęcherzyków płucnych – 95% nabłonka płuc; warstwa o grubości 0.1 – 0.2 m; przepuszczalny dla makrocząsteczek o MW <40 kDa. Powierzchnia adsorpcji około 75 m2. Biodostępność białek – 10 – 20% Podanie tą drogą – ominięcie metabolizmu wątrobowego Preparaty biofarmaceutyków do inhalacji: insulina: DPI (dry powder inhaler) – rozpylenie drobnego proszku do stojącego obłoku aerozolu; system AER – rozpylanie na mgłę roztworu białka przez mikroporowate folie - DNAza (mukowiscydoza), także terapia genowa mukowiscydozy (nośniki liposomowe)

10 Sposoby podawania leków białkowych
Podawanie doustne Białka podawane doustnie - <5% przechodzi do krwiobiegu (także gdy w kapsułkach zabezpieczających przed degradacją w żołądku). Niezmodyfikowane białko terapeutyczne ulega w ciągu max. 10 min degradacji w jelicie cienkim.

11 modyfikacje chemiczne za pomocą dużych obojętnych ugrupowań
Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych modyfikacje chemiczne za pomocą dużych obojętnych ugrupowań połączenie z drugą cząsteczką białka zwiększenie masy cząsteczkowej, - powyżej Da, tj. powyżej progu zdolności usuwania cząsteczek przez nerki zapobieganie degradacji cząsteczek przez proteazy

12 Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych
PEGylacja - przyłączanie kowalencyjne glikoli polietylenowych do białek terapeutycznych dłuższy okres wchłaniania, zmniejszenie procesu degradacji przez proteolizę zmniejszenie antygenowości zwiększenie stabilności termicznej i mechanicznej cząsteczki dłuższa eliminacja z organizmu

13 Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych
PEGylacja Przykłady stosowanych leków modyfikowanych: PEGylowana deaminanaza ( Adagen )- w terapii genetycznego niedoboru deaminazy adenozynowej PEGylowana L-asparaginaza (Oncospar), w terapii białaczki limfoblastycznej PEG- Intron (Pegintron- 2001) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C Pegasys (2002) - w terapii chronicznego zapalenia wątroby typu C

14 Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne
Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych Białka fuzyjne - zawierają białko terapeutyczne i białkowy fragment dodatkowy zwiększenie masy cząsteczkowej leku powyżej progu nerkowego wykorzystanie specyficznych właściwości przeciwciał dla wzmocnienia ukierunkowanego działania leku wyższa aktywność formy dimerycznej w porównaniu z monomeryczną

15 WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA
Białka fuzyjne PREPARAT WSKAZANIE TERAPEUTYCZNE FIRMA, ROK WPROWADZENIA Amevive (dimeryczne białko fuzyjne ) umiarkowana- groźna przewlekła łuszczyca Biogen 2003(USA) Enbrel ( dimeryczne białko fuzyjne powstałe z połączenia domeny receptora TNF z rejonem Fc IgG1 ) aktywne reumatoidalne zapalenie stawów u osób dorosłych, choroba Crohna Amgen I Wyeth 1998 (USA) Wyeth Europa Ltd 2000 (EU) Ontak ( białko fuzyjne złożone z rIL-2 i zmodyfikowanej toksyny błoniczej ) skórne chłoniaki z limfocytów T Ligand Pharmaceuticalis 1999 (USA)

16 Metody wydłużania biologicznego okresu półtrwania białek terapeutycznych
Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc TNF (tumor necrosis factor) czynnik martwicy nowotworów aktywne białko procesu zapalnego podstawowa rola w schorzeniach związanych ze stanami zapalnymi i schorzeniami autoimmunologicznymi

17 Enbrel: białko fuzyjne typu X –Fc powstałe przez połączenie zewnątrz-
komórkowej domeny receptora TNF ( sTNF ) z rejonem Fc immunoglobuliny Rys. schemat immunoglobuliny 1-fragment wiążący antygen 2- region Fab 3- region Fc

18 Strategie redukcji immunogenności biofarmaceutyków białkowych
Dla białek ludzkich jak najwyższa czystość preparatu Dla białek obcych zmiany sekwencji aminokwasowych zmiany stopnia glikozylacji tworzenie koniugatów z PEG

19 Produkcja sztucznych tkanek z zastosowaniem
biopolimerów i systemów kontrolowanego uwalniania substancji

20 Sposób postępowania w inżynierii tkankowej

21 Warunki efektywnego prowadzenia terapii metodą inżynierii tkankowej
znalezienie odpowiedniego materiału na matrycę, zapewniającego dobrą adhezję komórek, ich rozmnażanie się, a następnie różnicowanie możliwość przetworzenia biotworzywa matrycy na porowaty nośnik ustalenie optymalnych warunków hodowli komórkowej – aplikacji czynników wzrostu i innych substancji sprzyjających rozwojowi tkanki opracowanie odpowiednich form aplikacji zapewniających kontrolowane uwalnianie czynników wzrostu zarówno in vitro jak i in vivo

22 Transplantacja organów,a inżynieria tkankowa
Cel (w obydwu przypadkach): rekonstytucja organu utraconego (wypadki, nowotwory, martwica pocukrzycowa, wady wrodzone), lub poważnie uszkodzonego, niezdolnego do pełnienia swojej funkcji • Transplantacja – zabieg chirurgiczny wszczepienia organu pobranego od dawcy • Inżynieria tkankowa – działania zmierzające do regeneracji własnych tkanek lub narządów (także transplantacja komórek)

23 Źródła komórek: • Autologiczne (własne); zwykle niedostateczna ilość, można namnażać w hodowli; niebezpieczeństwo infekcji • Allogeniczne (od innego osobnika); immunogenne • Ksenogeniczne (pochodzenie zwierzęce, n.p. świńskie); immunogene, niebezpieczeństwo zakażenia retrowirusami

24 Komórki można podzielić pod względem stopnia zróżnicowania (komórki macierzyste, stem cells)
Wielopotencjalne (Pluripotencjalne) : EC (embrionic stem cells), EG (embrionic germ cells) Wielopotencjalne ukierunkowane: MSC (mesenchymal stem cells), HSC (hematopoietic stem cells), Komórki progenitorowe w dojrzałych tkankach: keratynocyty, hepatocyty, osteoblasty Komórki szpiku kostnego mogą różnicować się we wszystkie typy komórek, zależnie w jakie miejsce zostaną wszczepione („universal stem cells”). Niewykluczone, że transdyferencjacja jest wynikiem fuzji komórek somatycznych gospodarza i komórek macierzystych.

25 Regeneracja tkanek wymaga:
• 1. Odpowiednich komórek • 2. Macierzy (szkieletu, matrycy)- scaffold • 3. Czynników wzrostowych (growth facttors) Nie zawsze są wymagane wszystkie trzy elementy: - może wystarczyć sama warstwa porowatego kolagenu (np. regeneracja skóry; komórki migrują ze zdrowych tkanek - fibroblasty, które produkują białka i glikozaminoglikany tworząc tkankę skórną, scaffold ulega absorpcji) - lub same komórki (terapia komórkowa, cell therapy). Pierwsze rekonstrukcje skóry z użyciem matrycy i komórek keratynocytów oraz fibroblastów zaczęto przeprowadzać w roku 1980.

26 Funkcja matrycy (scaffold) podobna do funkcji naturalnej ECM:
• Podporowa - stanowi rusztowanie dla komórek • Stymuluje proliferację • Stymuluje różnicowanie • Stymuluje biosyntezę w komórce • Chroni uszkodzone miejsce przed infekcją i dalszymi uszkodzeniami

27 Pożądane cechy matrycy :
• Obecność połączonych mikroporów ( µm) poziomych i pionowych; rozprzestrzenianie podczas siania, migracja wewnątrz porów, przenikanie składników medium • Zastosowana na ranę powinna pozwalać na formowanie naczyń i migrację do jej wnętrza komórek i odprowadzanie produktów przemiany materii • Odpowiednia wytrzymałość mechaniczna przy dużej powierzchni porów (możliwość połączenia szwami z tkanką,odporna na rozciąganie) Biomateriały – szkielety polimerowe do adhezji, namanażania i różnicowania komórek (biodegradowalne polimery) Polimery naturalne: Kollagen, żelatyna, kwas hialuronowy, chityna Polimery syntetyczne: Organiczne: głównie poli--hydroksyestry, w tym: PGA (kwas poliglikolowy), PLA (kwas polimlekowy), kopolimer PLGA (kopolimer kwasu glikolowego i mlekowego) oraz PVA (polimer alkoholu winylowego) Nieorganiczne: hydroksyapatyt, fosforan wapnia Wspólną cechą jest porowatość umożliwiająca osiedlenie się znacznej ilości komórek (porowata gąbka)

28 Zdjęcia matryc polimerowych wykonane z zastosowaniem
elektronowej mikroskopii skanningowej Po lewej – matryca wykonana z PLGA, po prawej – matryca z PGA

29 Matryce ulegają zróżnicowanej degradacji i absorpcji w tkankach
• Naturalne biopolimery (kolagen, kwas hialuronowy, chityna) są rozkładane są na drodze hydrolizy enzymatycznej. z wyjątkiem chityny są to związki hydrofilowe – niska wytrzymałość mechaniczna w porównaniu do poli--hydroksykwasów • Poli-  -hydroksykwasy rozkładane są w procesie hydrolizy nieenzymatycznej • PVA- nie degraduje się

30 Szybkość rozkładu i absorpcji materiałów matrycowych
Czas degradacji powinien odpowiadać potrzebom danej tkanki: Regeneracja elementów układu kostnego – czas bardzo długi (lata) Regeneracja skóry – czas musi być krótki (do 1 miesiąca). Dłuższe pozostawanie niezdegradowanej matrycy może działać wręcz uszkadzająco zamiast promować regenerację

31 Wpływ rodzaju adhezji komórek do matrycy na funkcję komórek

32 Inżynieria tkankowa ex vivo z wykorzystaniem komórek autologicznych

33 Porównanie warunków inżynierii tkankowej ex vivo i in vivo (in situ)

34 Czynniki wzrostowe – niezbędne elementy inżynierii tkankowej
W warunkach in vivo czynniki wzrostowe (growth factors) wydzielane są przez komórki na własne potrzeby (sekrecja autokrynna), lub w odpowiedzi na sygnały nadchodzące od innych komórek (sekrecja parakrynna) • W procesie regeneracji tkanek czynniki wzrostowe są wydzielane przez komórki użyte do inżynierii tkankowej; • Nawet allogeniczna tkanka skórna uzyskana tą drogą wydziela czynniki wzrostowe do miejsca uszkodzonej tkanki, w której została ulokowana Najczęściej używane czynniki wzrostowe: • Bone morphogenetic proteins (BMPs), białka morfogenetycznekości (rodzina transformujących czynników wzrostu typu ) • Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, FGF-2) • Naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu, VEGF • Transformujący czynnik wzrostu nowotworów, TGF  • Czynnik wzrostu hepatocytów • BMP i bFGF są w stanie same stymulować regenerację kości i naczyń (czynniki różnicujące)

35 Różne możliwości kontrolowanego uwolnienia czynników
wzrostu do rozwijających się tkanek Po lewej – uwolnienie z matrycy polimerowej Po prawej – uwolnienie z implantu i mikrocząstki

36 Sposoby dostarczania czynników wzrostowych do regenerowanej tkanki:
• Bezpośrednie wstrzykiwanie DNA plazmidowego, które zawiera gen kodujący czynnik wzrostu • Transfekcja genu danego czynnika wzrostu do komórek, które będą przeszczepiane i transplantacja tych komórek do tkanki, która ma być regenerowana • Bezpośrednie związanie czynników wzrostowych z matrycą (GF związany najpierw z odpowiednim nośnikiem)

37 Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej
Możliwości regeneracji tkanek: kości (komórki szpiku: komórki podścieliska + komórki układu hematopoetycznego) chrząstki (chondrocyty + osteoblasty) wątroba (hepatocycty + fibroblasty) skóra (keratynocyty + fibroblasty) komórki mięśnia sercowego (kardiomiocyty + fibroblasty)

38 Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej
Schemat regeneracji kości (Ikada, 2006)

39 Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej
Regeneracja skóry

40 Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej
Regeneracja skóry Do produkcji ekwiwalentów skóry, matryca żelatynowa łączona bywa z chitozanem* i z kwasem hialuronowym (HA). Kwas hialuronowy poprawia wchłanialność wody, elastyczność i biokompatybilność. Na takiej matrycy inkubuje się keratynocyty i fibroblasty. Po 2 tygodniach można zaobserwować tworzące się warstwy nabłonka walcowatego i płaskiego, a badania immunohistochemiczne wykazują obecność lamininy i kolagenu (składników błony podstawnej). Chitozan*- otrzymywany z chityny izolowanej z pancerzy morskich skorupiaków. Wiążąc wiele cząsteczek wody, tworzy trwały żel absorbujący cząsteczki tłuszczów, węglowodanów, białek, cholesterolu, czynników wzrostowych Fragmenty skóry można też hodować na warstwie tkaniny bawełnianej lub nylonowej i na macierzy z poliuretanu

41 Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej
Hodowla hepatocytów (komórek wątroby) • Cel: transplantacja komórek wątrobowych (próby kliniczne w terapii genowej - transfer genów) • Cele badawcze • Hepatocyty b. trudno hodują się in vitro w zwykłych warunkach. Rosną lepiej na matrycy biopolimerowej (polimer kwasu glikolowego, PGA, lub kwasu mlekowego, PLLA) • Czynniki wzrostowe HGF (hepatocyte growth factor) • Wspólna hodowla z innymi komórkami (komórki nabłonka przewodów żółciowych, komórki wysepkowe trzustki) • Dodatek innych czynników: DMSO, nikotynamid • Namnożone hepatocyty wykorzystywać można do przeszczepów w leczeniu chorób metabolicznych, marskości wątroby i in. • Świetnie też nadają się do badań biologicznych, np. metabolizmu kwasów tłuszczowych, transportu aminokwasów, wiązania ligandów z receptorami, itp.