Dr Katarzyna Piwowarczyk pokój C122 (2.0.27) tel. 12 664 6183 Asystenci grup: BIOLOGIA KOMÓRKI dla BIOCHEMIKÓW

Prezentacja na temat: "Dr Katarzyna Piwowarczyk pokój C122 (2.0.27) tel. 12 664 6183 Asystenci grup: BIOLOGIA KOMÓRKI dla BIOCHEMIKÓW"— Zapis prezentacji:

1 dr Katarzyna Piwowarczyk pokój C122 (2.0.27) tel. 12 664 6183 katarzyna.szpak@uj.edu.pl Asystenci grup: BIOLOGIA KOMÓRKI dla BIOCHEMIKÓW http://www.uj.edu.pl/web/zbk/dydaktyka/kursy/wbt-336 Koordynator ćwiczeń: dr Marta Michalik pokój C118 (2.0.23) tel. 12 664 6144 marta.michalik@uj.edu.pl dr hab. Justyna Drukała pokój C124 (2.0.23) tel. 12 664 6145 justyna.drukala@uj.edu.pl

2 BIOLOGIA KOMÓRKI Ćwiczenia - zasady zaliczenia: uczestniczenie w zajęciach (dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona) przygotowywanie się na ćwiczenia (sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe) praktyczne zaliczenie ćwiczeń Charakterystyka kursu: 30 godzin wykładów 60 godzin ćwiczeń Prowadzący: wykłady: prof. dr hab. Zbigniew Madeja dr Marta Michalik ćwiczenia: nauczyciele akademiccy ZBK doktoranci ZBK Podstawowe zasady BHP: - Zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1 - Zasady BHP w pracowni chemicznej Ocena końcowa z kursu będzie liczona jako: 20% oceny z ćwiczeń 80% oceny z egzaminu Ocenę z ćwiczeń wystawiamy na podstawie: średniej arytmetycznej: wszystkich ocen cząstkowych otrzymanych przez studenta w trakcie ćwiczeń wraz z oceną z zaliczenia praktycznego

3 Zalecana literatura: · M. Pluta – Mikroskopia optyczna rozdz. 8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa. · L. Appel, R. Kowalczyk - Mikroskop. Budowa i użytkowanie. · B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część I, panel 1.1 · dostępny podręcznik fizyki doświadczalnej (dział – optyka- mikroskopy) · instrukcje dołączone do ćwiczenia Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń: - podstawowe pojęcia optyki, charakterystyka fali świetlnej; - budowa mikroskopu świetlnego jasnego pola - powiększenie, zdolność rozdzielcza mikroskopu, apertura numeryczna, - rodzaje mikroskopów świetlnych - budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo-fazowego Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z budową, zasadą działania i prawidłowym przygotowaniem mikroskopu świetlnego do pracy w trybie jasnego pola i kontrastu-fazowego PODSTAWY MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ Budowa i działanie mikroskopu jasnego pola i kontrastowo-fazowego

4 KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE JASNEGO POLA I KONTRASTOWO-FAZOWYM; Barwienie cytochemiczne komórek Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się: - z zastosowaniem mikroskopu świetlnego z optyką do jasnego- pola oraz do kontrastu- fazowego - z metodami utrwalania i barwienia komórek zwierzęcych Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: - Zastosowania mikroskopu świetlnego jasnego pola oraz kontrastowo-fazowego w badaniach biologii komórki - Możliwości wizualizacji struktury wewnątrzkomórkowej komórek eukariotycznych w mikroskopie jasnego-pola i kontrastowo-fazowym - Utrwalanie i barwienie komórek zwierzęcych: różne metody, ich zalety i ograniczenia - Określanie rzeczywistych wymiarów obiektów biologicznych Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część pierwsza, panel 1-1 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fazowo-kontrastowa. E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej; rozdziały 2 i 3.

5 PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 1 Barwienia przyżyciowe organelli wewnątrzkomórkowych mitochondria endosomy Hoechst DiOC6 Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się: - z budową i działaniem mikroskopu fluorescencyjnego - wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych do wizualizacji organelli w żywych komórkach Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: - Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego - Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej - Budowa i funkcje podstawowych organelli wewnątrzkomórkowych komórki ssaka - Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdziały 14 i 15 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str. 473-517 E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej, rozdział 4 W. Kilarski: Strukturalne podstawy biologii komórki; rozdział 1 i 4

6 oit.cm-uj.krakow.pl Muchomor sromotnikowy (m. zielonawy, Amanita phalloides) pl.wikipedia.org falloidyna fluorochrom - TRITC (izotiocyjanian rodaminy) + Jak wykorzystać niebezpieczną truciznę do celów naukowych? …czyli wizualizacja cytoszkieletu aktynowego w komórkach prawidłowych (mysie fibroblasty linii 3T3) z hodowli in vitro za pomocą znakowanej fluorescencyjnie falloidyny ! ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1) Organizacja cytoszkieletu aktynowego w mięśniach i komórkach niemięśniowych 2) Funkcje cytoszkieletu aktynowego w komórkach niemięśniowych 3) Mechanizm skurczu mięśni prążkowanych 4) Białka motoryczne związane z filamentami aktynowymi 5) Rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu aktynowego ZALECANA LITERATURA B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdział 17 red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdział 7 red. R Makuch i M. Rędowicz: Cytoszkielet; Kosmos, 2001, t.50, nr 3, str. 283-295 red. H. Strzelecka-Gołaszewska: Motory molekularne, Kosmos, 2001, t.50, nr 4, str. 349-358; 375-390 PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 2 Budowa i funkcje cytoszkieletu –barwienie F-aktyny

7 HODOWLE KOMÓREK in vitro ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ: 1. „Hodowla komórek i tkanek in vitro”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz II, str 49-63; 2. „Wzrost komórek”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz X, str 345-65; 3. „Metody badań budowy i funkcji komórek”. SEMINARIA Z CYTOFIZJOLOGII pod redakcją J.Kawiaka i M.Zabla. 2002; rozdz 14, str 364-9; 4. „Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami”. PODSTAWY CYTOFIZJOLOGII pod redakcja J Kawiaka i wsp.. 1998. str. 488-504 5. OBSŁUGA KOMORY BUERKERA 6. „Mammalian Cell Culture. Methods. Dieter F. Huelser. 7. Materiały zawarte w instrukcjach do ćwiczeń. Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z podstawowymi procedurami związanymi z hodowlami prawidłowych i nowotworowych komórek in vitro

8 info.wiadomosci.gazeta.pl www.dziennikpolski24.pl Wykonanie bankowania (1), rozbankowania komórek (2), weryfikacja prawidłowości przeprowadzenia procedur (test witalności komórek). BANKOWANIE KOMÓREK vitalmedica.pl „General guide…” John A. Ryan -80°C daigger.com 1 2 ZALECANA LITERATURA „Molecular biology of the cell” Fifth edition, Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Garland Science Taylor & Francis Group, Part III Chapter 8 Manipulating proteins, DNA, and RNA - Isolating cells and growing them in culture str. 501-510 „Hodowla komórek i tkanek” pod redakcją Stanisławy Stokłosowej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 - rozdz. 1 str. 2-6, rozdz. 5 str. 45-50, rozdz. 6 str. 51-60, rozdz. 11 str. 140-152 www.alcor.org doz.pl ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA Hodowla tkanek, jej rozwój i znaczenie dla rozwoju nauki. In vitro versus in vivo, zalety, ograniczenia, klasyfikacja hodowli tkanek. Środowisko hodowlane. Linie komórkowe. Bankowanie komórek. Cel ćwiczenia: zapoznanie z podstawowymi technikami bankowania komórek

9 TESTY WITALNOŚCI KOMÓREK Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się z podstawowymi testami witalności wykorzystywanymi na co dzień w pracy laboratoryjnej ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Transport przez błonę komórkową 2. Testy witalności – rodzaje, zastosowanie, ograniczenia 3. Barwniki stosowane do wizualizacji struktur w komórkach żywych i utrwalonych ZALECANA LITERATURA: 1. Instrukcja do ćwiczeń 2. Seminaria z cytofizjologii Pod redakcją Jerzego Kawiaka i Macieja Zabla (rozdz.4 i 6). 3. Podstawy cytofizjologii, Praca zbiorowa pod Redakcją J.Kawiaka, J.Mireckiej, M.Olszewskiej, J.Warchoła (rozdz.2 str 58-90 i rozdz.4 358-376)

10 WZROST KLONALNY KOMÓREK ZWIERZĘCYCH ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: Molekularne podstawy transformacji nowotworowej i tworzenia przerzutów. Hodowle komórek in vitro. Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami, wzrost komórek na podłożach stałych i półpłynnych. ZALECANA LITERATURA: B. Alberts. Podstawy biologii komórki. PWN 2005. rozdz. 21. J. Kawiak i in. Podstawy cytofizjologii. PWN 1995, rozdz. 29. B. Alberts. Molecular Biology of the cell. Garland Science 2002, rozdz. 23. Większość komórek nowotworowych hodowanych in vitro, w przeciwieństwie do komórek prawidłowych, nie wykazuje zależności wzrostu od przyczepienia do podłoża. Celem ćwiczenia jest założenie półpłynnej hodowli komórek szczurzego mięsaka XC, a następnie obserwacja powstałych kolonii.

11 PINOCYTOZA ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: ·1. Przebieg procesu endocytozy – drogi transportu pęcherzykowego w komórce (szlaki endocytarne; przedziały endosomalne) ·2. Różne mechanizmy endocytozy (fagocytoza, makropinocytoza, endocytoza przez pęcherzyki otoczone klatryną, endocytoza przez kaweole) ·3. Znaczenie procesu endocytozy dla komórki zwierzęcej i organizmu ZALECANA LITERATURA: · B. Alberts i inni.- „Podstawy Biologii Komórki”, red. H. Kmity i P. Wojtaszka, PWN 2005; Rozdz.15. · B. Alberts et al. – Molecular Biology of the cell. – 4th. Ed. Garland Science 2002, part IV/13. · Strukturalne podstawy biologii komórki „Transport pęcherzykowy” – W. Kilarski, Warszawa 2003; rozdział: 5.1. D. Cichoń, M. Michalik. Wnikanie wirusów do komórek na drodze endocytozy –mechanizmy i wybrane aspekty kliniczne. Mikrobiologia Medycyna 4: 16-26, 2004. Ćwiczenie ma na celu obserwację (w mikroskopie kontrastowo-fazowym) zjawiska pinocytozy indukowanej zachodzącej w komórkach pierwotniaków (Amoeba proteus) oraz sprawdzenie czy aktywność pinocytozy zależy od czynników zewnętrznych (skład jonowy pożywki, pH).

12 WPŁYW ANESTETYKÓW NA RUCHLIWOŚĆ KOMÓREK ZWIERZĘCYCH Zalecana literatura: Podstawy Biologii Komórki. Wprowadzenie do Biologii Molekularnej. Alberts i wsp. Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1. Mechanizm działania anestetyków. 2. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych. 3. Cytoszkielet aktynowy i mikrotubularny - rola w migracji komórek; rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu i migracji. 4. Rola jonów wapnia w migracji komórek. lidokaina Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z mechanizmami ruchu komórek zwierzęcych oraz obserwację wpływu etanolu i jonów wapnia na ruchliwość ameb. Amoeba proteus, by Wim van Egmond

13 FUZJA KOMÓREK …to proces łączenia się dwóch lub więcej komórek w jedną strukturę, podczas którego dochodzi do zlewania się błon, w wyniku czego powstają struktury o nowych cechach i funkcjach. Ćwiczenie ma na celu obserwację zjawiska fuzji, przyczepionych do podłoża komórek szczurzego mięsaka XC, wywołanej działaniem glikolu polietylenowego (PEG) o masie cząsteczkowej 6000. Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń: 1. Budowa błony komórkowej. 2. Fuzja błon komórkowych: a) związki chemiczne wywołujące fuzję; b) warunki niezbędne do fuzji; c) zjawisko fuzji w procesach fizjologicznych; d) praktyczne zastosowanie zjawiska fuzji. Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdz. 11(str. 365-388), rozdz. 15 (str. 512-516). J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdz. 6 (str. 127-141). Praca zbiorowa po redakcją J. Kawiaka: „Podstawy cytofizjologii” Warszawa 1998; część II (str. 58-78). Praca zbiorowa pod redakcją J. Kawiaka i K. Ostrowskiego: Cytofizjologia, 1990; rozdz.2 (str. 56-58), rozdz. 13 (str. 406-408).

14 KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz zbudowane są z dwóch koneksonów, heksamerów białek z rodziny koneksyn Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z prosta techniką wizualizacji komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego 2. Test żywotności komórek z wykorzystaniem dwuoctanu fluoresceiny Zalecana literatura: 1. Instrukcje do ćwiczeń 2. Alberts, Biologia komórki

15 Zastosowanie metod wirowania do rozdziału komórek ssaczych - SEPARACJA KOMÓREK W GRADIENCIE GĘSTOŚCI Ćwiczenie ma na celu: Zapoznanie się z podstawowymi technikami separacji komórek zwierzęcych oraz próbę rozdzielenia komórek różniących się gęstością wypornościową przy zastosowaniu wirowania w nieciągłym gradiencie gęstości Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1.Zasady separacji komórek 2.Podstawowe techniki separacji komórek 3.Sposoby weryfikacji czystości otrzymanych frakcji. Zalecana literatura: 1. P.C. Turner, A.G. Mc Leeman, A.D. Bates, M.R.H. White Krótkie wykłady- Biologia Molekularna (Sekcja A2- izolacjia organelli) 2. Alberts, Podstawy Biologii Komórki od str 17 (jedność i różnorodność komórek)/ str 32-33 (panel)/ 160-161- (panel- rozbicie komórek i frakcjonowanie)

16 Uwaga: „Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń” oraz „Zalecana literatura” mogą zostać uaktualnione przez asystenta prowadzącego dane ćwiczenie. Informacje na ten temat zostaną zamieszczone na tablicy dla studentów (obok wejścia do Sali ćwiczeń ZBK) oraz na stronie www kursu Biologia komórki, najpóźniej tydzień przed planowanymi zajęciami. Proszę sprawdzać komunikaty.

17 PRAKTYCZNE KOLOKWIUM ZALICZENIOWE SAMODZIELNE WYKONANIE JEDNEGO Z PONIŻSZYCH ZADAŃ: - Ustawienie preparatu w mikroskopie jasnego pola, w trybie kontrastu faz lub mikroskopie fluorescencyjnym; - Przeprowadzenie testu witalności komórek; - Oznaczenie gęstości komórek w zawiesinie; - Wykonanie pasażu komórek.