DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

METODY MOLEKULARNE PCR Hybrydyzacja FISH Sekwencjonowanie

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY Polimerase Chain Reaction (PCR) Pozwala na powielenie dowolnej sekwencji DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów Polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy kwasu nukleinowego z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA

IZOLACJA RNA (wirusy) Przygotoanie próbek krwi, skóry, włosów itd. Dezintegracja komórek – TRIZOL, Chloroform Odwirowanie zanieczyszczeń Zamrożenie RNA (- 800 C)

MECHANIZM REAKCJI CZYNNIKI: Jednoniciowa matryca DNA Startery (primery) dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów) Polimeraza DNA

CYKL PCR Denaturacja DNA (92 - 960 C) Przyłączanie starterów do matrycy (37-720 C) Polimeryzacja DNA (720 C)

DENATURACJA (> 900 C)

PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW (37-720 C) Sekwencja duplikowana Primer 1 Primer 2 5’ 3’

WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW (720 C) Sekwencja duplikowana 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 1 Polimeraza Taq DNA Wolne nukleotydy Primer 2 3’ 5’ 5’ Sekwencja duplikowana 3’

POWIELONA SEKWENCJA DNA

LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA PODCZAS REAKCJI PRC Cykle Liczba łańcuchów DNA 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824

PROFIL TERMICZNY PCR DENATURACJA DENATURACJA POLIMERYZACJA PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

METODY DIAGNOSTYCZNE OPARTE NA PCR PCR MULTIPLEKSOWY: Równoczesna amplifikacja kilku regionów genomu w jednej probówce stosując różne pary starterów. (Diagnostyka chorób genetycznych, wykrywanie mutacji, wykrywanie czynników zakaźnych)

NESTED PCR: Dodanie zestawu nowych (bardziej swoistych) starterów po przeprowadzeniu wstępnej reakcji PCR. (Kontrola swoistości reakcji, stworzenie sondy molekularnej z produktu PCR) KOMPETYTYWNY PCR: Analiza ilościowa badanego fragmentu genomu.

PCR-RFLP Produkt amplifikacji jest poddawany procesowi cięcia enzymami restrykcyjnymi, w wyniku czego otrzymuje się fragmenty DNA różnej długości. RT-PCR Właściwy PCR jest poprzedzony odwrotną transkrypcją (przepisaniem informacji z RNA na DNA) dzięki enzymowi: odwrotna transkryptaza.

ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR) Stała temperatura (370 C) w czasie 30 min.

Nazwa i pochodzenie enzymu Jon aktywujący Uwagi Tth PolymeraseZ Thermus thermophilus Mn++ Termostabilna, z jonami Mg wykazuje aktywność polimerazy DNA MMuLV RewerseTranskryptaseZ Moloney Murine LeucemiaVirus Mg++ najpowszechniej stosowana odwrotna Transkryptaza AMV ReverseTranskryptaseZ Avian MyeloblastosisVirus Coraz powszechniej stosowana odwrotna Transkryptaza Cth Polymerase Klenow FragmentZ Carbohydrothermus hydrogenoformans Stosowana w mieszaninie z Taq polimerazą do jednostopniowej reakcji RT-PCR

ASYMETRYCZNY PCR: Dodanie pary starterów z których jeden zostaje całkowicie zużyty podczas pierwszych cykli amplifikacji DNA. (Produkt może być sondą molekularną w reakcji hybrydyzacji lub matrycą w reakcji sekwencjonowania.) AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA: Ważna jest tu komplementarność nukleotydów przy końcach 3` primerów, ponieważ umożliwia ona elongację DNA przez polimerazę. (Badanie polimorfizmu alleli, punktowych mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie działania substancji mutagennych, wykrywanie genów sprzężonych z chorobami, badanie lekooporności mikroorganizmów

ANALIZA PRODUKTÓW PCR ELEKTROFOREZA Elektroforeza kwasów nukleinowych obecnie przeprowadzana jest głównie na żelach agarozowym i akryloamidowym oraz w tzw. płynnych (nisko spolimeryzowanych) żelach akryloamidowych w kapilarach.

ELEKTROFOREZA AGAROZOWA Produkt PCR pod wpływem napięcia elektrycznego wędruje w żelu agarozowym.

ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA Jest powszechnie, chociaż niesłusznie uważana za bardziej precyzyjną od agarozowej oraz (słusznie) za tańszą. Zaletami tego podłoża są niskie koszta oraz możliwość wybarwiania rozdzielonych frakcji DNA poprzez srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne gołym okiem i trwałe obrazy.

Wybarwianie elektroforetycznie rozdzielonego na żelu DNA może być przeprowadzane za pomocą bromku etydyny lub innego, podobnego barwnika (np. SYBR Gold, który jest o wiele czulszy lecz znacznie droższy), natomiast w przypadku elektroforezy kapilarnej szczególnie popularne jest wielokolorowe barwienie fluorescencyjne, wykorzystujące wzbudzoną laserem fluorescencję wbudowanych w łańcuch DNA fluorochromów.

HYBRYDYZACJA Wykorzystuje sondy molekularne (kwas nukleinowy o określonej sekwencji), będące odcinkami komplementarnymi do szukanych fragmentów genomu. Najważniejsze typy to: Southern blotting - badanie DNA Northern blotting – badanie RNA

SONDY MOLEKULARNE

SONDY MOLEKULARNE

  Mikromacierz nylonowa 8 x 12 cm Mikromacierz nylonowa (powiększenie) 4 x 5 mm 

HYBRYDYZACJA in situ (FISH) Pozwala zlokalizować sekwencję kwasu nukleinowego w komórce lub odpowiednim rejonie chromosomu. Znakomita większość sond wykorzystywanych w metodzie FISH znakowana jest bezpośrednio fluorochromem. Najczęściej stosowanymi fluorochromami są fluoresceina (FITC), rodamina, czerwień teksańska (Texas Red) i Aqua (DEAC).

  Metoda M-FISH Hybrydyzacja in situ multipleksowa Obraz chromosomów komórek linii raka prostaty 

SEWENCJONOWANIE: Polega na określeniu sekwencji nukleotydów. Metoda chemiczna – chemiczne rozszczepianie kolejnych nukleotydów badanego fragmentu DNA. Metoda enzymatyczna (Sangera) – synteza komplementarnej nici DNA na matrycy wykorzystująca system znakowania trójfosforanów czterech dideoksynukleotydów fluorochromami w czterech różnych kolorach, są 3 warianty:

1. Dye Primer Sequencing - przeprowadza się cztery niezależne reakcje PCR z czterema porcjami primera, każda porcja znakowana jest fluorochromem w innym kolorze. Produkty czterech reakcji miesza się i analizuje wspólnie. 2. Cycle Sequencing - startuje się z bardzo małą ilością DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po każdej denaturacji termicznej uzyskuje się coraz dłuższy łańcuch zakończony znakowanym nukleotydem. 3. Dye Terminator Sequencing - używa się mieszanki nie znakowanych trójfosforanów nukleotydów i znakowanych trójfosforanów dideoksynukleotydów. Była stosowana przez konkurujące zespoły naukowe które z sukcesem zakończyły sekwencjonowanie genomu człowieka.

Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA Starter komplementarny do matrycy DNA 5’ 3’ GCCTAGGGTTTGCGCTAC 3’ CGGATCCCAAACGCGATGCAGGCATGCAATGACC 5’ dATP dGTP dTTP dCTP ddCTP ddTTP ddATP ddGTP Terminatory znakowane fluorescencyjnie Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA Rozdział produktów reakcji w automatycznym sekwenatorze GTCCGTACGTTACTGddG GTCCGTACGTTACTddG GTCCGTACGTTACddT GTCCGTACGTTAddC GTCCGTACGTTddA GTCCGTACGTddT Detektor GTCCGTACGddT GTCCGTACddG GTCCGTAddC GTCCGTddA GTCCGddT GTCCddG GTCddC GTddC GddT ddG Laser

-=*=-