Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowych w surowicach ANA-dodatnich w oparciu o analizę poszczególnych swoistości przeciwciałowych obecnych w KKI. Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna Pyka Zakład Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii Warszawa

Autoprzeciwciała występujące w układowych chorobach tkanki łącznej Czynniki reumatoidalne Przeciwciała skierowane przeciwko antygenom jądrowym (ANA) i antygenom związanym strukturalnie lub funkcjonalnie z nimi Przeciwciała przeciwko fosfolipidom Przeciwciała przeciwko składnikom tkanki łącznej i innych tkanek gospodarza oraz białkom cytoszkieletu Przeciwciała przeciwko antygenom bakterii, wirusów oraz pasożytów

Oznaczenie obecności oraz mian i/lub poziomów wyżej opisanych autoprzeciwciał przeciwko antygenom komórkowym wykonuje się zasadniczo z czterech następujących powodów: obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej choroby, miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla aktywność procesu chorobowego, obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi, autoprzeciwciała są inhibitorami enzymów istotnych dla funkcjonowania komórki.

Częstość występowania oraz swoistość wybranych autoprzeciwciał “markerowych” w układowych chorobach tkanki łącznej* wysoka 60% anty-NuHi niska 20% anty-SSB /La/ 30% anty-SSA /Ro/ anty-U1 RNP 70% anty-histonowe >95% 3% anty-PCNA 10% anty-rybosomalne białko P 15% anty-Sm >90% anty-dsDNA 95% dodatnie ANA SLE Swoistość /dla danego schorzenia/ Częstość występowania /w danym schorzeniu Autoprzeciwciało Jednostka chorobowa

niska 40% anty-U1 RNP wysoka 25% anty-Jo-I umiarkowana 20% dodatnia cytoplazma dodatnie ANA Zespół nakładania zapalenia wielo-/skórno-mięśniowego >85% 15% anty-jąderkowe >90% anty-Scl-70 anty-centromerowe 90% Skleroderma 60% anty-α-Fodryna 70% IgM RF IgA RF anty-SSB /La/ 80% anty-SSA /Ro/ Zespół Sjögrena >95% MCTD MPO-ANCA anty-histonowe Toczeń polekowy

wysoka ~ 30% anty-CCP umiarkowana 15% GS-ANA 15 – 30% IgM RF 60% anty-histonowe 70% dodatnie ANA MIZS niska 40% 50% 40-60% IgA RF 75% Rzs 100% anty-kardiolipinowe Zespół antyfosfolipidowy *Dane pochodzą z opracowania Statens Seruminstitut /Kopenhaga, Dania/ zalecanego przez European Consensus Finding Study i mogą nieznacznie różnić się od danych w tekście /pochodzących z konkretnych cytowanych prac/

Przeciwciała wykrywane w układowych chorobach tkanki łącznej ! Metody immunofluorescencyjne Metody immunoprecypitacyjne Odczyny immunoaglutynacyjne ● Metody immunoenzymatyczne ● Metody nefelometryczne

Przyczyny niepowodzeń 1. Typ testu (czułość testu) 2. Skład antygenowy testu 3. Antygeny rekombinantowe 4. Natura antygenu /podfrakcje/ 5. Wieloswoistość surowic 6. Normy 7. Kompleksy immunologiczne – – – – – – – – – – – – – – – – – 8. Wiek pacjenta

Porównanie częstości identyfikacji określonej swoistości ANA w grupie 76 surowic uzyskanych od pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej 1/80 ANA (-)‏ ANA (+)‏ 1/160 1/320 i >

Kaskadowa metoda oznaczania swoistości przeciwciał ANA

Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, jak ma miejsce w TRU, gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom poziomów i awidności autoprzeciwciał. Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia choroby zwykle towarzyszyć mogą dwa zjawiska, pierwsze to wyrzut z zajętych narządów/tkanek do krążenia autoantygenów, drugie to związanie autoprzeciwciał krążących w KKI. Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem aktywnego procesu destrukcji narządów/tkanek, a drugi prowadzi do neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich mian w surowicach.

Celem pracy była analiza KKI pod kątem ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich, w których klasycznymi metodami stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić swoistości przeciwciał ANA.

Materiał i metody Badania przeprowadzono na grupie 588 surowic skierowanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii IR w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia swoistości ANA. Surowice pochodziły z klinik i Polikliniki IR.

Materiał i metody W surowicach oznaczano następujące parametry: ·miano i typ świecenia ANA metodą IIF na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2 (firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą „Colorzyme” (firmy Immunovision, USA), ·poziomy autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland Sp. z o.o.), ·poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA), ·frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp. ·frakcję γ z osadów PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconego siarczanu amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej, ·białko we frakcji γ i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg Kalckara.

Wyniki Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-)

Wyniki Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-), gdzie w osadach PEG znaleziono autoprzeciwciała

Porównanie typów „świecenia” w met Porównanie typów „świecenia” w met.IIF z surowic(1a,2a) i osadów PEG(1b,2b)

Przykłady swoistości autoprzeciwciał znalezionych w surowicach i osadach PEG metodą Western-blott

Struktura KKI

Wybrany przykład neutralizacji surowicami anty-Fc i Fab swoistości przeciwciał występujących w osadach PEG A B C A - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 B - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą antyF(ab2) C - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą anty-Fc

Szczegółowa analiza składu KKI na podstawie neutralizacji swoistości surowicami anty-Fc i anty-(Fab2) Lp. pacjent Swoistości oznaczane metodą Western blotting w wybranych surowicach oraz w osadach PEG Surowica osady PEG-6000 ANA typowanie swoistości Kontrola* +sur. antyFab* +sur.antyFc* miano typ świecenia 1 KS 1/5120 plamisty anty Hp-ślad antyRo+ antyHp++ antyDNA+ antyRo ślad antyHp ++ antyDNA słaby+ antyRo + antyHp++ antyDNA+ 2 JZ 1/640 antyRo +/- antyHp ślad antyRo-60 +/- antyRo-52 + +/- +/- Ślad + 3 WK homogenno-plamisty antyHp +/- antyHp+ antyDNA+ ślad - - ślad - ślad 4 GO 1/1280 antyHp+ antyDNA+/- + - + +/- 5 FO 1/320 antySmB +/- antySmB++ antySmD ślad ++ ślad ++ ślad 6 RL (-) antyHp słaby + antyDNA słaby + + słaby+ ++ + 7 PK antyRo ślad antyRo+/- antyHp+++ antyDNA+ ślad + ślad + ++ słaby+

Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się aktywności przeciwciałowej po precypitacji glikolem polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Daltonów jest efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu glikolem czy też mamy do czynienia ze zmianą konformacji poszczególnych białek wchodzących w skład KKI – będzie to przedmiotem dalszych badań w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii.

Autorzy w przedstawionej pracy zaproponowali nowe metodyczne podejście do analizy surowic ANA-pozytywnych, w których nie udaje się standardowymi metodami ustalić swoistości autoprzeciwciał. Zaproponowana metoda polega na analizie swoistości autoprzeciwciał nie w surowicy pełnej, ale w osadach po PEG-6000 (czy ewentualnie frakcjach γ z tego osadu), który zawiera obok innych makroglobulin surowiczych, także zgęszczoną frakcję KKI. Stosując tę metodę udało się ustalić swoistość przeciwciał występujących w KKI w 84% surowic ANA(+), w których metodą standardową nie udaje się tego dokonać. Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich podejście, po niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki przeciwciał uproszczeniach, znajdzie zastosowanie w serodiagnostyce autoprzeciwciał markerowych, i to nie tylko w układowych chorobach tkanki łącznej.

Dziękuję za uwagę