J Świerkot, R Ślęzak, P Karpiński, J Pawłowska, L Noga   Określenie roli polimorfizmów genów uczestniczących w metabolizmie MTX na skuteczność terapii i działania niepożądane u chorych na RZS Akademia Medyczna we Wrocławiu Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych Zakład Genetyki

Polimorfizm genetyczny Ford – 1940 rok występowanie więcej aniżeli jednego prawidłowego allelu dla określonego locus genowego, z częstością większą niż 1% polimorfizm może występować na wielu poziomach i dotyczyć różnorodności: sekwencji DNA, sekwencji aminokwasowych, struktur chromosomalnych.

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu 99,9% sekwencji DNA jest u ludzi identyczna różnice pojedynczego nukleotydu w danej pozycji = SNP single nucleotid polimorphism. 1 na 300 nukleotydów wykazuje zmienność międzyosobniczą większość znajduje się w tzw. obszarach niekodujących

The Human Genome Diversity Project Od kilkunastu lat realizowany jest międzynarodowy Projekt Poznania Różnorodności Genomu Ludzkiego w 2003 roku w bazie tej zarejestrowano ok. 6 mln SNP w styczniu 2005 było już 21 mln SNP

Zmiany sekwencji DNA w regionie kodującym lub regulatorowych genów mogą zmieniać: strukturę białka modyfikować aktywność enzymów wpływać na ekspresję informacji genetycznej oddziaływać na mechanizmy kontrolne biorące udział w podziale i rozwoju komórki

Wpływ genów na efektywność terapii lek Absorbcja Dystrybucja Metabolizm Wydzielanie stężenie lek gen Działania niepożądane komórka receptor G-proteina > lub < skuteczności gen gen

Cel pracy Określenie roli wybranych markerów klinicznych i biomarkerów ze szczególnym uwzględnieniem wpływu polimorfizmów genów: MTHFR C677T i A1298C, (reduktaza metylenotetrahydroflianowa) RFC1 A80G, (przenośnik zredukowanych folianów) TYMS 2R/3R i 6bp ins/del, (syntaza tymidylanowa) GGH C401T, (hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa) TC P259R, TC I219L, TC L376S i TC M198T na skuteczność i działania niepożądane w trakcie terapii metotreksatem u chorych na RZS.

RFC - przenośnik zredukowanych folianów GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa TYMS- syntaza tymidylanowa MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa ATIC - transformylaza rybonukleotydowa 5-amino-4- karboksyamidu DHFR-reduktaza dihydrofolianowa

RFC - przenośnik zredukowanych folianów GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa TYMS- syntaza tymidylanowa MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa TC - transkobalamina

Materiał i metody 270 chorych na RZS spełniających kryteria ARA z 1987 roku aktywna postać choroby: OB > 30 mm/h i/lub CRP > 1,5 mg/dl, minimum 4 bolesne i 3 obrzęknięte stawy, DAS 28 > 3,2

Zasady dawkowania leków MTX - doustnie w początkowej dawce 10-15 mg/tydz Następnie do 8-12 tygodnia chorzy byli leczeni MTX w dawce 15 mg jeden raz w tygodniu jeśli nie uzyskano, co najmniej umiarkowanej poprawy i jednocześnie nie było istotnych działań niepożądanych dawkę zwiększano do maksymalnie 25 mg, nie szybciej jednak niż o 5 mg co 2 tygodnie.

Ocena kliniczna i laboratoryjna Kontrole 0, 2, 4, 6 miesiącu Ocena kliniczna liczba bolesnych i obrzękniętych stawów oceny nasilenia bólu dokonywanej przez chorego (VAS) oceny aktywności choroby wg chorego i lekarza DAS28 ogólna ocena sprawności fizycznej chorego Kwestionariusz Oceny Stanu Zdrowia - HAQ) badania laboratoryjne (OB, CRP) ocena występowania działań niepożądanych.

MTHFR - reduktaza metyleno tetrahydrofolianowa 1298 A/C- elektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR-RELP Homozygota typu dzikiego 1298 AA (produkt: 56bp); heterozygota 1298AC (produkty: 84bp i 56bp); homozygota typu 1298CC (produkt: 84bp).

Syntetaza tymidylowa (2R/3R) - elektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR-RELP Homozygota typu dzikiego- allel zawierający 2 powtórzenia 2R ; heterozygota 2R/3R powtórzenia; homozygota allel zawierający 3 powtórzenia 3R

MTHFR TYMS RFC1 GGH TC Gen Częstość XX Częstość XZ Częstość ZZ C677T Polimorfizm Częstość XX Częstość XZ Częstość ZZ MTHFR C677T 48 42 10 A1298C 57,5 0,5 TYMS 2R/3R 16 57 27 6bp ins/del 55 38 7 RFC1 G80A 31,5 50 18,5 GGH T401C 52 42,5 5,5 TC L376S 92 1 I219L 75,5 24 P259R 20 59 21

Rodzaj działania niepożądanego Zmuszający do odstawienia MTX Łącznie Zmuszający do odstawienia MTX Żołądkowo-jelitowe 80 (33%) 23 (9,5%) aktywności transaminaz 18 (7,5%) 5 (2%) Hematologiczne 8 (3,3%) 4(1,6%) Pulmonologiczne 7 (2,9%) 6 (2,5%) Łysienie 28 (12%) Osłabienie, ból głowy 34 (14%) Zakażenia 9 (3,8%) 1 (0,4%) Skóra i błony śluzowe 2 (0,8%) Guzki pometotreksatowe RAZEM (liczba chorych) 128 (53%)* 40 (16,5%)

Skuteczność Dz. N. – łącznie Dz.N. – gastroentero- logiczne Dz.N. – neurolo- giczne Dz. N. – hepatolog- giczne Dz.N. - łysienie Wiek MTX P=0,01 P=0,98 P=0,15 P=0,26 P=0,12 P=0,045; OR=2,46 czas RZS przed MTX P=0,14 P<0,01 P=0,18 P=0,004 OR=2,46 Aktywność choroby P=0,0001 P=0,002; OR=6,96 P=0,04; OR=4,28 P=0,95 P=0,039 Stopień RZS P=0,46 P=0,47 P=0,60 P=0,50 P=0,56 P=0,21 MTX 1/2 P=0,043 P=0,88 P=0,48 P=0,02; OR=0,27 Glikokorty kosteroidy P=0,65 P=0,36 P=0,74 P=0,25 Papierosy P=0,87 P=0,13 P=0,80 P=0,43 P=0,19

Wyniki – wpływ polimorfizmów na skuteczność Bez IS różnic: MTHFR C677T i A1298C, RFC-1 A80G, TYMS 2R/3R i 6bp ins/del, GGH C401T, TC P259R i TC I219L i TC L376S Genotyp MTHFR 677CC - 1,8 x > skuteczność (p=0,051) > skuteczność gdy kombinacja genotypów MTHFR 677 CC +RFC 80AA +MTHFR 1298AA (18/100%:163 /74%) p=0,039 Homozygoty MTHFR 677CC - szybsza dobra odpowiedź na leczenie MTX (OR=3,4; p=0,001)

Polimorfizmy w których stwierdzono istotne statystycznie różnice w częstości występowanie wszystkich działań niepożądanych OR=2,0 OR=3,7 OR=2,0

Polimorfizmy związane z istotnie statystycznymi różnicami w częstości występowanie wzrostu aktywności aminotransferaz OR=3,4 OR=3,6

Genotyp Skuteczność Brak (n, %) Umiarkowana + dobra (n, %) OR p MTHFR 677 CC +RFC80GG +MTHFR1298AA /pozostałych 56(26) 18 (100) 163 (74) 0.039 Działania niepożądane - łącznie obecne Pozostałe polimorfizmy / MTHFR 677CC + TC198TT 74 (41) 37 (64) 107 (59) 21 (36) 2.54 0.004 MTHFR677CC+ TC198TT+GGH401TT+TYMS 2R 84 (42) 27 (71) 117 (58) 11 (29) 3.41 0.002 pozostałe polimorfizmy/ MTHFR 677CC+GGH401TT 51 (38) 60(57) 83 (62) 45 (43) 2.16 0.005 Działania niepożądane - hepatologiczne pozostałe / MTHFR677CC+GGH401TT + RFC80GG 133(88) 89 (99) 17 (12) 1 (1) 11.37 0.008

badania laboratoryjne wywiad badanie fizykalne rozpoznanie badania genetyczne ocena aktywności badania laboratoryjne i obrazowe

„Dla każdego coś dobrego” U.S. News and World Report, January 24, 2003

Czy to tylko marzenia? Możliwość identyfikacji polimorfizmu genów odpowiedzialnych za metabolizm leków Różnice w genach u poszczególnych osób dotyczące klirensu leku i skutecznej dawki Potrzebna kropla krwi Czas oczekiwania 8 godzin Amplichip CYP450 Array

Różnice w „odpowiedzi” na leki „Gdyby nie było różnic między ludźmi medycyna byłaby tylko nauką, a nie sztuką” Sir William Osler (1849-1919)

CZY badania te są opłacalne?

v Badana cecha – wyniki wyjściowe Odpowiadający p Liczba chorych 185 nieodpowiadający p Liczba chorych 185 55 Wiek (lata) średnia ± SD zakres 54±10 50±11 * p<0.01 Płeć, kobiety % 80 83 NS DAS 28 4,2±0.8 4,7±0.6 * Liczba pacjentów seropozytywnych (RF) % 60 67 Średnia dawka MTX (min/max) 15 (12,5 -25) 15 (12,5-25) MTX jako pierwszy LMPCH/MTX kolejny 81 68 * Suplementacja kwasem foliowym % 100 Jednocześnie glikokortykosteroidy % 66 63 Jednocześnie NSLPZ % 76 74 Okres RZS wg Steinbrockera I+II/II+IV % 46/54 50/50 Palenie papierosów % 39 35 v

RFC1-zredukowany nośnik folianów ; RFC1-zredukowany nośnik folianów ; FPGS-syntetaza folylpoliglutaminianowa; TS- syntetaza tymidylowa ; DHFR-reduktaza dihydrofolianów; 5,10 MTHFR, -reduktaza metyleno-tetrahydrofolianowa AICAR - transformylaza 5-aminoimidazol0-4-karboxamido-rybonukleotydowa JA Wessels. Rheumatology 2008;47:249–255

MTHFR C677T. Wzór prążków badanego polimorfizmu uzyskanego metodą PCR-RFLP. linia 8. homozygota typu 677TT (175bp) linia 9. homozygota typu dzikiego (198bp), linia 10. heterozygota (obecność dwóch produktów175bp +198bp)

Jakie marzenia na przyszłość Testy SNP będą wystandaryzowane dla populacji pacjentów Wyniki testu będą dostępne w codziennej praktyce i umożliwi to indywidualizację terapii Zmapowanie SNP całego genomu będzie miało istotne znaczenie w doświadczeniach nad nowymi lekami

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu analizy SNP może pomóc w prognozowaniu występowania i w określeniu obrazu klinicznego takich chorób jak astma, cukrzyca, migrena, choroby serca, rzs. Choroby te dziedziczy się wieloczynnikowo, a ich występowanie w dużym stopniu jest uzależnione od czynników środowiskowych. W przyszłości wynik analizy SNP stanie się prawdopodobnie również podstawą tworzenia genetycznych „wizytówek” człowieka.

TT i TC > tox. hepatotox 677TT i CT > tox > AlAT Polimorfizm Liczba chorych Rasa Dawka Czas obs. Działania niepożądane efektywność praca C677T 58 biała 10-20 3 677CC <tox Schmeling 2005 93 żółta 15 6 Kumaqgai 2003 10-15 12 Berkun 2004 C677 T 113 15-25 ?? Van Ede 2002 236 10-25 TT i TC > tox. hepatotox Van Ede Art 2001 106 rózna 24 677T >tox 677C >?? Raczej 0 Urano Pharmacog. 677TT i CT > tox > AlAT Evans 2001 105 ? Haagsma 1999

Działania niepożądane efektywność praca Polimorfizm Liczba chorych Rasa Dawka Czas obserwacji Działania niepożądane efektywność praca A1298C 58 biała 10-15 6 1298AA < Schmeling 2005 93 żółta 10-20 12 Kumaqgai Int j mol 15-25 3 1298CC < AA AA to 5,24 x > Berkun 2004 106 różny 1298C > Urano Pharmaco. 308 1298 A > Hughes 2006 205 15 1298 AA > wczesny rzs Wessels 2006 83 24 James

1. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G 1055 chorych na RZS 455 – etanercept, 450 - infliksimab Czas badania – 6 msc. Ocena skuteczności – DAS28 , HAQ TNF 308AA – gorsza odpowiedź na etanetcept (n=6; p=0,007), ale nie na infliksimab (n=17) TNF 238 GA – gorsza odpowiedź na infliksimab (n=40; p=0,028) ale nie na etanercept (n=33) Maxwell JR. Hum Mol Genet. 2008 Nov 15;17(22):3532-8.

Cechy idealnego leku Lek który działa Lek który jest bezpieczny Dawki które są właściwe dla konkretnego chorego

3. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G 81 chorych na RZS Adalimumab 24 tygodnie Ocena skuteczności terapii: - DAS28 88% z 308GG i 68% z 308 GA dobrze odpowiadało na leczenie adalimumabem (p=0,05)

Tworzenia nowych standardów bezpieczeństwa i skuteczności terapii Prowadzenie badań klinicznych ze znanymi fenotypowo pacjentami dla określenia polimorfizmów SNP odpowiedzialnych za skuteczność terapii Prowadzenie obserwacji post-marketingowych dla zidentyfikowania profilu SNP charakterystycznego dla działań niepożądanych

Informacje podstawowe, definicje Gen – czynnik genetyczny zawierający pojedynczą jednostkę dziedziczenia. Oznacza odcinek DNA kodujący syntezę pojedynczego łańcucha polipeptydowego Allel – jedna z kilku alternatywnych form genu leżącego w danym locus Locus genu – pozycja zajmowana przez gen w chromosomie

4. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G 388 chorych z Francji uczestniczących w badaniu ReAct (adalimumab lub adalimumab + MTX lub adalimumab + inny LMPCH) 12 tygodni 40% chorych uzyskało minimum poprawę ACR50% Pojedynczo TNF 238A/G, 308A/G, 857 C/T nie miały wpływu na skuteczność i działania niepożądane TNF 238G+308G+857C - to mniejszy odsetek dobrze odpowiadających (34/50%) Miceli-Richard C. Ann Rheum Dis. 2008 Apr;67(4):478-84.

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu Najczęściej jest spotykany polimorfizm dwualleliczny rzadziej trójalleliczny SNP występujące w genach i obszarach regulatorowych decydują o indywidualnej charakterystyce danego osobnika Gęstość i nasycenie SNP nie są jednak identyczne dla całego genomu. największe zagęszczenie jest locus HLA na chromosomie 6. na chromosomie X zidentyfikowano „pustynie SNP”.

Indywidualizacja terapii Pojedynczy SNP jest obecny w 5% całej populacji, ale w 95% chorych z działaniami niepożądanymi Częstość działań niepożądanych min. 5% SNP test może zmniejszyć częstość działań niepożądanych do 0.25% Korzyści zwiększenie bezpieczeństwa, zmniejszenie konieczności wykonywania badań kontrolnych, zwiększenie skuteczności terapii

Korzyści wynikające z wykonania testu fenotypowania/genotypowania Możliwość szybkiego podjęcia decyzji dotyczącej dawki leku (optymalizacja skuteczności i tolerancji) Osoby „słabo metabolizujące”: uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego tolerancji (pozorna idiosynkrazja) Osoby ultraszybko metabolizujące: uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego zbyt małym jego stężeniem

Korzyści wynikające z wykonania testu fenotypowania/genotypowania c.d. 4. Fenotypowanie może w dużym stopniu zastąpić monitorowanie stężenia leku w klinice 5. Wykonanie jednego z powyższych testów ułatwia prawidłowe wprowadzenie nowego leku do terapii przez zastosowanie bezpiecznej dawki 6. Test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i koszty są usprawiedliwione zwłaszcza w przypadku leczenia długotrwałego

. RFC1G80A. Wzór prążków badanego polimorfizmu uzyskanego metodą PCR-RFLP. Homozygota typu dzikiego 80AA (2 produkty); heterozygota 80GA (4 produkty); homozygota 80GG (3 produkty). AA GG GA