Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Tomasz Sacha Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005

Aberracje cytogenetyczne w ostrych białaczkach Zmiany numeryczne: Hipodiploidia (mniej niż 46 chromosomów) w 10-15% OBS Hiperploidia w 5-19% OBL, 2-3% w OBS Zmiany strukturalne (>200 powtarzalnych opisanych): Bez uchwytnego związku z określonym typem białaczki - +8, -7, 7q- lub 5q- Występujące częściej w określonych typach białaczek

Niekorzystne rokowniczo Aberracje cytogenetyczne w ostrej białaczce szpikowej – znaczenie rokownicze Korzystne rokowniczo t(15;17) PML-RARalfa, Mbcr i mbcr (M3), t(8;21), AML-ETO (AML:20%, M2:40%)* 20-30% AML inv 16, CBF-MYH11 (M4eo)* kariotyp prawidłowy kariotyp „inny”, złożone aberracje Pośrednie ryzyko Niekorzystne rokowniczo

Podział białaczek wg WHO I. Ostre białaczki szpikowe (OBS) OBS z określonymi zmianami cytogenetycznymi t(15;17), PML/RARalfa+ (M3 wg FAB) t(8;21), AML/ETO + (M2 wg FAB) inv 16, CBFbeta/MYH1+ (M4eo wg FAB) 11q23, MLL z wieloliniową dysplazją OBS o nieokreślonej specyfikacji cytogenetycznej (wg FAB) II. Ostre białaczki limfoblastyczne

Użyteczność metod biologii molekularnej w diagnostyce ostrych białaczek Bardzo heterogenna grupa osób z prawidłowym kariotypem, lub kariotypem „others” (np.40-60% AML) Zmiany submikroskopowe: aberracje wewnątrzgenowe: duplikacje, mutacje punktowe, MLL,FLT3, c-KIT,RAS małe insercje lub delecje Zmiana ekspresji genów: EVI1, BAALC, WT1

Chromosom Philadelfia Powstaje gen hybryda Bcr/Abl Translokacja między chromosomami 9 i 22

t(9;22)(q34;q11) in the course of CML 5 1 2 3 6 8 9 10 12 7 11 17 13 14 15 16 18 21 22 19 20 X Y YOUR LOGO HERE 7 Department of Haematology, Collegium Medicum Jagiellonian University, Kraków, Poland

t(9;22)(q34;q11), BCR/ABL - FISH analysis 8 8

BCR-ABL ABL BCR e1a2 b2a2 b3a2 e19a2 m-bcr M-bcr -bcr Ib Ia a2 a3 a11

10

Stopień redukcji patologicznego klonu komórek stwierdzanego dostępnymi metodami badawczymi - poziomy (typy) odpowiedzi. 13 10 Diagnoza / nawrót 12 100 Remisja hematologiczna 10 Ph’ dodatni 11 10 10 Remisja cytogenetyczna (Ph’+ = 0) 10 1 10 Real-Time PCR dodatni 9 0.1 10 8 0. 01 10 Stosunek BCR-ABL / ABL (%) Całkowita ilość komórek białaczkowych 7 0. 001 10 Gniazdowa RT-PCR dodatni 6 0. 0001 Remisja molekularna 10 5 10 4 10 BCR-ABL niewykrywalny 3 10 2 10 10

Zalety konwencjonalnego badania cytogenetycznego Detekcja dodatkowych aberracji cytogenetycznych Wykrywanie resztkowej populacji zdrowych komórek hemopoetycznych Określenie charakterystycznego polimorfizmu chromosomalnego

Anomalie cytogenetyczne zaostrzenia CML Najczęstsze anomalie trisomia 8 izochromosom i(17) trisomia 19 dodatkowy chromosom Ph’ Rzadsze anomalie monosomia 7 monosomia 17 monosomia Y trisomia 17 trisomia 21 translokacja t(3;21) (q26;q22)

Wady konwencjonalnego badania cytogenetycznego Brak wykrywania Ph’ u ok. 10% chorych na CML Trudności techniczne - wymóg uzyskania odpowiedniej ilości dobrych jakościowo, dzielących się komórek. Niska czułość

Zalety hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) Możliwość badania ilościowego Analiza większej ilości komórek niż w klasycznej cytogenetyce Wysoka wiarygodność w ocenie odpowiedzi cytogenetycznej Materiał: krew obwodowa

Wady hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) Wyniki fałszywie pozytywne Badanie nieprzydatne gdy Ph’ w < 5-10% komórek

Zalety i wady RT-PCR (reakcja odwrotnej transkrypcji i polimerazowa reakcja łańcuchowa) Czułość: 10^-5 - 10^-6 - zaleta czy wada? Konieczność szczególnej kontroli: wyniki fałszywie ujemne wyniki fałszywie dodatnie Wyniki negatywne mimo CML? Trudności interpretacyjne: diagnostyczne monitorowanie leczenia

Introduction of Q-PCR for monitoring of Bcr-Abl Bcr-Abl after allo-SCT detected by RT-PCR 1 Bcr-Abl pos. 2 Bcr-Abl neg. 3 4 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 moths after allo-SCT 1996 - ECMLSG: Q-PCR is appropriate method for Bcr-Abl monitoring Real-time Q-PCR is recommended as a sensitive and accurate method of MRD monitoring in CML patients treated with imatinib

Amplification plot of patient samples analyzed in Dept Amplification plot of patient samples analyzed in Dept.of Haematology, Kraków by Real-Time Q-PCR AbiPrism 7700.

Bcr-Abl kinetics in CML patients in Chronic Phase treated with Imatinib - Real-Time Q-PCR Comb.Th Transcript level vs positive control BC

Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR Ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej silnie koreluje z odsetkiem komórek Ph’ + w szpiku Wzrastająca ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej poprzedza wystąpienie nawrotu cytogenetycznego i hematologicznego.

Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR Informacja o wzroście ekspresji BCR/ABL krytyczna dla pacjentów z alternatywnymi możliwościami leczenia (auto-, mini allo-, standardowa allotransplantacja, inne) Informacja o minimalnej ilości komórek białaczkowych istotna w przewidywaniu długotrwałej kontroli choroby Wartość prognostyczna ilości bcr/abl we krwi obwodowej po 3 miesiącach terapii Imatinibem dla uzyskania odpowiedzi cytogenetycznej (redukcja >3 log) 22

Potencjalne mechanizmy oporności na imatinib Wzrost komórek niezależny od aktywności Bcr-Abl Wzrost komórek zależny od aktywności Bcr-Abl Amplifikacja/ hiperekspresja genu BCR-ABL Mutacje w domenie kinazy Wtórne zaburzenia genetyczne Imatinib Bcr-Abl Zmutowana Bcr-Abl Ewolucja klonalna von Bubnoff et al. Leukemia. 2003;17:829.

Miejsca mutacji w obrębie domen kinazy Y253F E355G M244V Q252H Q252H M351T L248V E255V E255K F317L F359V G250E T315I H396R S417Y E459K F486S E279K “P loop” Miejsce wiązania ATP Pętla aktywacyjna koniec karboksylowy Ilość pacjentów z daną mutacją Różne mutacje tego samego aminokwasu

Zależność pomiędzy występującą mutacją BCR-ABL a fazą CML French Cooperative Study Group (2004) CP AP p BP n=52 n=17 n=10 P-loop 19% 47% 0.028 50% T315l 15% 18% ns 40% Inne 66% 35% 0.029 10% średni czas trwania leczenia imatinibem 30 mcy (2-54) średni czas monitorowania leczenia 42 mce (4-54)

Występowanie mutacji BCR-ABL a progresja CML French Cooperative Study Group (2004) Progresja (def): zgon, faza akceleracji, faza kryzy blastycznej P-Loop i T315L Inne p (n=18) (n=34) Progresja 61% 26,5 0,019 11/18 9/34 P-Loop T315L Inne p (n=8) (n=10) (n=24) Progresja 50% 75% 26,5 ns 5/10 6/8 9/34

Pokonanie oporności poprzez zwiększenie dawek imatinibu French Cooperative Study Group (2004) Oceniani pacjenci odpowiedź (czas) 1/10 (10%) CHR: 1 (2.5 mo) MCR: CCR: P-loop 10/18 (56%) E255K 0/6 CHR: MCR: CCR: T315I 6/11) (55%) 11/24 (46%) Inne 24/40 (60%) (M244V,E275K,M351T F359V,V379I,L387M, H396R) CHR: 7 median 16,1(6,2-29) MCR: 2 10 i 21,5 mcy CCR: 2 9 i 18 mcy

t(15;17) t(9;22) inv(16) Schoch et al. PNAS, 99, 10008-13, 2002

t(9;22) t(15;17) inv(16) t(11q23)/MLL Kohlmann et al. GCC, 37, 396-405, 2003