Niewirusowe (syntetyczne) nośniki DNA Magdalena Dudek Paulina Kucharzewska

Metody transfekcji Metody wprowadzania transgenu (genu reporterowego lub terapeutycznego) oraz syntetycznych oligonukleotydów do komórek docelowych: - fizyczna (mikroiniekcja, elektroporacja, metoda biolistyczna – strzelba genowa), - chemiczna (DEAE-dekstran, Ca2+, syntetyczne nośniki DNA) - wirusowe (adenowirusowe, AAV, retrowirusy i inne).

Syntetyczne nośniki DNA Grupę niewierusowych nośników DNA tworzą różne związki chemiczne i struktury ponadmolekularne (supramolekularne) obdarzone ładunkiem dodatnim: - lipidy i liposomy kationowe - LIPOPLEKSY kationowe polipeptydy i białka polimery i kopolimery kationowe, - dendrymery POLIPLEKSY

Lipidy i liposomy kationowe Liposomy to sferyczne, dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidu obdarzonego ładunkiem ‘+’ i cząsteczek lipidu obojętnego elektrostatycznie. DOTMA (lipofektyna) DOPE (L-dioleilofosfatydyloetanoloamina) obojętny lipid

Kationowe polipeptydy i białka poli- L-lizyna (PLL) poli- L- ornityna białka np. protamina, histony, ludzka albumina

Polimery i kopolimery kationowe Naturalne polimery kationowe chitozan Syntetyczne polimery kationowe poli – β aminoestry rozgałęziona PEI

Dendrymery Dendrymery to wysokocząsteczkowe polimery o dobrze zdefiniowanej architekturze i wyróżniające się jednorodnością i rozkładem ładunków, np. polimery poliamidoaminowe (PAMAM). grupy funkcyjne rdzeń (amoniak, D-glukoza)

Zalety niewierusowych nośników DNA brak ograniczenia wielkości transgenu brak integracji z genomem małe ryzyko rekombinacji genetycznej możliwe podawanie systemowe możliwość transfekowania wielu typów komórek nie powodują odczynu zapalnego i mogą być wielokrotnie stosowane

Pożądane właściwości niewirusowych nośników: - biokompatybilność (brak toksyczności i immunogenności, stabilność in vivo) łatwe w podawaniu klinicznym, bez powikłań genetycznych (mutagenności) i odpowiedzi układu odpornościowego, niewygórowany koszt i prosty schemat syntezy, produkowane w dużej ilości z dużą wydajnością stabilne w czasie przechowywania, wysoka wydajność transfekcji komórek, wysoka specyficzność transfekcji

Bariery uniemożliwiające obecnie stosowanie kompleksów DNA-syntetyczne nośniki w terapii: 1. Produkcja, formowanie i stabilność. 2. Bariery pozakomórkowe: opsoniny komórki fagocytujące macierz pozakomórkowa enzymy trawienne 3. Bariery wewnątrzkomórkowe: błona komórkowa endosomy/lizosomy błona jądrowa

Produkcja, formowanie i stabilność stosunek nośnik kationowy/DNA - określa on rozmiar kompleksu i jego powierzchniowy ładunek (rozmiar kompleksu a wydajność pobierania w drodze endocytozy) steryczna stabilizacja nośników - niewirusowe nośniki w celach terapeutycznych muszą być stosowane w dużych stężeniach (agregacja i precypitacja). Rozwiązanie – kowalencyjne przyłączanie polietylenoglikolu (PEG) do lipopleksów i polipleksów cytotoksyczność wysokocząsteczkowych nośników (PEI800 – uszkodzenie błony komórkowej)– stosowanie niskocząsteczkowych polikationów np. chitosan, PEI25 stabilność podczas przechowywania – liofilizacja polipleksów i lipopleksów w obecności substancji ochronnych (cukry)

Warunki udanego transferu genów do komórek 1. Dotarcie DNA do powierzchni komórki 2. Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej 3. Przejście kompleksu przez błonę 4. Przejście DNA przez cytoplazmę 5. Wejście DNA do jądra komórkowego 6. Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym

Bariera pozakomórkowa In vivo, w obecności osocza, kompleksy o wypadkowym ładunku dodatnim mają utrudniony dostęp do tkanek docelowych. Przyczyny: agregacja kompleksów w krwi, duży, dodatni ładunek odpowiedzialny za niespecyficzne oddziaływanie z macierzą zewnątrzkomórkową, powierzchnią wielu komórek, białkami osocza, opłaszczenie kompleksów przez białka osocza-opsoniny i ich eliminacja z krwiobiegu i płynów pozakomórkowych w wyniku fagocytozy przez komórki żerne w wątrobie i śledzionie, aktywacja układu dopełniacza i eliminacja nośników

Bariera pozakomórkowa Próby zwiększenia stabilności kompleksów nośnika z DNA w krwiobiegu: utworzenie na zewnętrznej powłoce nośników niewirusowych warstwy hydrofilowej z kopolimerów np. kopolimer metakrylanowo-metakrylamidowy (HPMA) czy polietylenoglikol (PEG) przyłączone kowalencyjnie do kompleksów polilizyna/DNA nadają oporność na działanie białek surowicy i zapobiegają agregacji. Stopień stabilizacji rośnie wraz z długością łańcucha polimeru oraz jego gęstością na powierzchni cząsteczek nośnika PEG

Bariera pozakomórkowa znaczne zwiększenie stabilności kompleksu kopolimer-DNA poprzez usieciowanie niektórych składników kopolimerowych na zewnętrznej warstwie kompleksu np. nośnik oparty na poli-L-lizynie, której I-rzędowe grupy aminowe usieciowane są za pomocą czynnika sprzęgającego dimetylo-3,3’-ditiobispropionoimidu (DTBP), kompleks ten dodatkowo jest pokryty PEG maskującym ładunek i zwiększającym rozpuszczalność kompleksu. DTBP mostki disiarczkowe ulegające redukcji w cytoplazmie zmniejszają stabilizację całego kompleksu i umożliwiają uwalnianie DNA

Bariera pozakomórkowa Zwiększenie specyficzności transfekcji komórek za pomocą nośników zawierających swoiste ligandy dla receptorów na powierzchni komórek docelowych : - nośnik lipidowo-peptydowy złożony z liposomów kationowych oraz cząsteczek peptydu z trójaminokwasowym motywem RGD (oddziaływanie nośnika z receptorami integrynowymi powierzchni komórek), nośniki z mannozylową pochodną cholesterolu (man-C4-Chol) – wydajna transfekcja komórek z receptorami dla mannozy np.makrofagi, kationowy polimer poli-L-lizyna/galaktoza – wydajna transfekcja in vivo komórek z receptorami asjaloglikoproteinowymi (np. hepatocyty), nośniki z ligandem w postaci transferyny – wydajna transfekcja komórek nowotworowych. Ligandy dołączone do końca długich linkerów (łączników) np. PEG

Bariera wewnątrzkomórkowa Lipopleksy i polipleksy łączą się z daną komórką za sprawą oddziaływań z ujemnie naładowanymi proteoglikanami na powierzchni komórek, bądź za sprawą receptorów dla ligandów obecnych na powierzchni nośników. Oba mechanizmy prowadzą do pobrania tych związków przez komórkę na drodze endocytozy. W cytoplazmie komórki, kompleksy znajdują się w pęcherzykach endocytarnych, które po endosmolizie uwalniają kompleks do cytoplazmy lub ulegają fuzji z lizosomami (źródło aktywnych enzymów litycznych prowadzących do zniszczenia kompleksu i degradacji terapeutycznego DNA.

Bariera wewnątrzkomórkowa Stabilność i losy endosomu ENDOCYTOZA endosmoliza fuzja z lizosomem (aktywacja enzymów litycznych uwolnienie kompleksu do cytoplazmy zniszczenie kompleksu i degradacja terapeutycznego DNA

Bariera wewnątrzkomórkowa Wydajność uwalniania kompleksów nośnik-DNA z endosomów do cytoplazmy jest uzależniona od obecności w nośniku składnika zdolnego do destabilizacji błony endosomu. Wykorzystywane czynniki fuzyjne: w liposomach – fosfatydyloetanoloamina (DOPE), podjednostki pewnych toksyn bakterii z rodzaju Diphteria i Pseudomonas, elementy strukturalne niektórych wirusów np. białka kapsydu adenowirusa albo fragment hemaglutyniny wirusa grypy. Inne związki: melityna (kationowy peptyd, główna toksyna jadu pszczelego o własnościach litycznych), polietylenoimina PEI – przy spadku pH z 7 do 5 stopień protonacji PEI wzrasta z 20 do 45% - napływ jonów Cl- i osmotyczne pęcznienie endosomów („efekt gąbki protonowej”)

Bariery wewnątrzkomórkowe Wejście transgenu do jądra komórki: pasywne - plazmidowy DNA może wniknąć do jądra, podczas podziału komórki (łatwość transfekowania komórek intensywnie dzielących się) aktywne – plazmidowy DNA związany z białkiem lub inna cząsteczką zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) rozpoznawany przez receptory jądrowe z rodziny importyn Alza's Stealth liposomes encapsulate a drug (red) in a phospholipid bilayer (blue and white). A polyethylene glycol coating (green) allows the liposomes to evade the immune system, increasing the half-life of the drug in the body.

Zwiększenie wydajności transferu transgenu do jądra – konstrukcja nośników syntetycznych z wirusowymi sygnałami lokalizacji jądrowej w połączeniu z innymi białkami np. białko fuzyjne GAL4-NLS (GAL4 – drożdżowy czynnik transkrypcyjny) ligandy: FGF i laktoza wydają się wpływać na lepszy transport polipleksów do jądra sekwencje nukleotydowe wprowadzane do plazmidowego DNA (sekwencje najwyższej zgodności dla czynników transkrypcyjnych)

Literatura: M.E. Davis, Non-viral gene delivery systems, Current Opinion in Biotechnology, 13:128-131, 2002 M.Thomas, A.M. Klibanov, Non-viral gene therapy: polycation-mediated DNA delivery, Appl Microbiol Biotechnol, 62:27-34, 2003 S. Szala, Terapia genowa, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

DZIĘKUJEMY ZA UWAGĘ