CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA JAKO METODA FENOTYPOWANIA KOMÓREK KRWI Anna Noatynska Dorota Feret

CYTOMETRIA PPZEPŁYWOWA Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy. FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting) rozszerzona metoda cytometrii przepływowej, w której oprócz pomiarów komórek są stosowane również urządzenia sortujące.

MIERZONE SYGNAŁY rozproszenie światła przez badaną próbkę, intensywność fluorescencji składników komórki, lub zastosowanych barwników, absorbcja światła przez próbkę, pomiary w czasie (użyteczne dla badania kinetyki, dynamicznych zachowań populacji komórek)

ELEMENTY BUDOWY CYTOMETRU

TUBA Z PRZEPŁYWEM LAMINARNYM PRÓBKI komórki w zawiesinie, przepływ w cienkim strumieniu cieczy przez oświetlaną objętość umożliwia pomiar pojedynczych komórek.

PRZEPŁYW KOMÓREK fluorescencja promień lasera tu nakładamy próbkę ciecz osłaniająca fluorescencja promień lasera Purdue University Cytometry Laboratories

OPTYKA źródło światła: laser lub lampa rtęciowa, detektory: diody, fotopowielacze, filtry optyczne, lustra,

ŚWIATŁO ROZPROSZONE

PRZEDNI DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Forward Scatter) Ilość światła rozproszonego wzdłuż osi przebiegu światła wzbudzającego jest zbierana przez przedni detektor światła rozproszonego (forward scatter channel). Intensywność tego światła jest proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu i granularności cytoplazmy.

PRZEDNI DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO laser detektor przedni Purdue University Cytometry Laboratories

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO (Side Scatter) Ilość światła rozproszonego prostopadle do osi przebiegu światła wzbudzającego jest zbierana przez boczny detektor światła rozproszonego ustawiony pod kątem 900 (side scatter channel). Intensywność tego światła jest proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu i granularności cytoplazmy.

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO laser detektor przedni detektor boczny Purdue University Cytometry Laboratories

FLUORESCENCJA

DETEKTORY FLUORESCENCJI Fotopowielacze (ilość od 2 do 4) można używać kilku barwników fluorescencyjnych lub wyznakowanych przeciwciał. Selektywność sygnału zapewniają odpowiednio dobrane filtry optyczne i lustra.

DETEKTORY FLUORESCENCJI detektory fluorescencji przedni laser Fluorescence detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

SYSTEM OPTYCZNY laser PMT 5 próbka PMT 4 lustro dichroiczne PMT 3 przepływ komórek detektor światła rozproszonego laser filtr zaporowy

ELEKTRONIKA Urządzenia do przetwarzania sygnału na obraz (wartości) cyfrowe, System komputerowy do przechowywania i obróbki danych (list mode)

PRZECHOWYWANIE I OBRÓBKA DANYCH (LIST MODE) Entry No. Value Cell Number Parameter 1 2 3 4 5 6 7 8 - k 80 100 40 20 90 120 110 50 75 1 2 n FSC SSC Green Red

PARAMETRY MIERZALNE ZA POMOCA CYTOMETRU STRUKTURALNE rozmiar, kształt, cytoplazmatyczna ziarnistość, zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny, aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna, zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów,

PARAMETRY MIERZALNE ZA POMOCA CYTOMETRU cd... FUNKCJONALNE ładunek powierzchniowy, ekspresja receptorów powierzchniowych, integralność błony (żywotność), aktywność endocytarna, organizacja cytoszkieletu, aktywność enzymów,

WIELOPARAMETROWA ANALIZA Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: jednowymiarowe (histogram), dwuwymiarowe (kropkowy, gęstości, konturowy), wykresy trójwymiarowe (perspektywiczny).

Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej HISTOGRAM Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej Count 200 400 600 800 1000 G0 / G1 S G2 / M zawartość DNA 2N 4N G2 M G0 G1 S

HISTOGRAM DNA pik G0-G1 odpowiada ilości DNA = 2n w fazie G0 i G1 G2-M obszar S to rozkład zawartości DNA w fazie S cyklu komórkowego ilość komórek S pik G2-M odpowiada ilości DNA = 4n w fazie G2 i M intensywność fluorescencji

WYKRES DWUWYMIAROWY (KROPKOWY)

WYKRES DWUWYMIAROWY (KROPKOWY) PI – jodek propidyny komórki martwe – barwi DNA martwych komórek Aneksyna- FITC (fluoresceina) –łączy się z fosfatydyloserną obecną w na zewnątrz błony komórek apoptotycznych PI FL2-H aneksyna V-FITC FL1-H komórki apoptotyczne komórki żywe

trzy populacje komórek: Na przykład: niebieska, zielona czerwona, trzy populacje komórek:

Wykres trójwymiarowy (przedstawia trzy mierzone parametry)

IMMUNOFLUORESCENCYJNA ANALIZA KOMÓREK KRWI Głównym zastosowanie cytometrii jest analiza i sortowanie komórek krwi. Jest to możliwe dzięki: ekspresji różnych markerów powierzchniowych ( antygeny CD – przeciwciała monoklonalne anty-CD znakowane fluorescencyjnie). różnicom w wielkości jądra i granularności cytoplazmy (różnice w stgnałach FSC i SSC)

LEUKOCYTY CD 45 + GRANULOCYTY CD 14 + AGRANULOCYTY MAKROFAGI MONOCYTY NEUTROFILE LIMFOCYTY EOZYNOFILE LIMFOCYTY T CD 4 + CD 3 + LIMFOCYTY B CD 19 + BAZOFILE

WYKRES KRWINEK NA PODSTAWIE ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO SS 90 Degree Scatter 200 400 600 800 1000 LIMFOCYTY MONOCYTY NEUTROFILE FS 1000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 SKALA 1000 Purdue University Cytometry Laboratories

Na przykład: MONOCYTY NEUTROFILE „Multi parametric investigation of immunem system during major surgery by LSC”

Limfocyty 2 populacje : CD3+CD4+ oraz CD3- CD4+ LIMFOCYTY CD3+CD4+ LIMFOCYTY CD3- CD4+ „Multi parametric investigation of immunem system during major surgery by LSC”

PODSUMOWANIE: zalety cytometru przepływowego W zależności od jakości cytometru można badać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie analizowania bardzo licznych populacji obiektów w krótkim czasie, oraz pozwala osiągnąć wysoką dokładność i zminimalizować rozrzut wyników.

W ciągu kilku sekund można z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć subpopulacje rzadko występujące i nietypowe Ogólnie, cytometria przepływowa jest wspaniałym nieinwazyjnym (tzn. nie naruszającym integralności komórkowej) narzędziem badawczym w wieloparametrowej ocenie struktury i funkcji komórek. możliwość oznaczenia ploidii w komórkach o określonym fenotypie

PURDUE UNIVERSITY CYTOMETRY LABOLATORIES (CD volume 5,6 2000) LITERATURA: PURDUE UNIVERSITY CYTOMETRY LABOLATORIES (CD volume 5,6 2000) www.cyto.purdue.edu

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ!

When cells are in such altered states You don't know where to set the gates, It's best to minimize the risk And store them all on your hard disk. If there's a clog before you're done, You'll save some data from a run, And, thus, you may stay out of jams You'd get in with live histograms. List mode, just work in list mode; When you consider all the options, it's the only thing to do. This mode, and only this mode, Lets you make sense of samples which, at first, leave you without a clue. Once we're in list mode, anyway, With prices as they are today, It isn't putting on the Ritz To digitize to sixteen bits. It's clear that, once we've made this change, We'll have enough dynamic range To transform data digitally, So log amps will be history.

List mode, we'll work in list mode, ... List mode, we'll work in list mode, And go from linear to log and back without the log amps' ills. Once we've got list mode, our only pissed mode May be when we try pinning down which agencies will pay the bills. List mode helps us analise How many molecules of dyes And antibodies will be found On each cell type to which they're bound. At long last, different labs can see Results compared objectively, Advancing science as a whole And aiding quality control. List mode, by using list mode, We'll alt get heightened sensitivities and much reduce the fears And trepidation of calibration, Although the folks who make the particles may have us by the spheres.

From East to West, from South to North, We'll send our data back and forth, Why, we'll soon have it in our reach To run our samples from the beach. But, unless they've been well prepared, When they are run, we'll run them scared, List mode or not, there's still no doubt That garbage in gives garbage out. List mode, we all need list mode, Though there are ends for which list mode itself can never be the means. Even with list mode, there won't exist code Which gets good data from bad samples and/or misaligned machines.