OGÓLNE ZASADY DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Anna Majewska

DROBNOUSTROJE BAKTERIE WIRUSY GRZYBY

DROBNOUSTROJU Z ORGANIZMEM RODZAJE INTERAKCJI DROBNOUSTROJU Z ORGANIZMEM DROBNOUSTROJE KOMENSALNE DROBNOUSTROJE OPORTUNISTYCZNE DROBNOUSTROJE PATOGENNE

DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA CEL: IDENTYFIKACJA CZYNNIKA ETIOLOGICZNEGO ODPOWIEDZIALNEGO ZA ZAKAŻENIE OKREŚLENIE JEGO PROFILU WRAŻLIWOŚCI NA CHEMIOTERAPEUTYKI NADZÓR MIKROBIOLOGICZNY I EPIDEMIOLOGICZNY

POBRANIE MATERIAŁU TRANSPORT METODA DIAGNOSTYCZNA

PRÓBKI MATERIAŁU DO BADANIA MIKROBIOLOGICZNEGO WYMAZ Z GARDŁA I MIGAŁKÓW, PLWOCINA, WYMAZ Z RANY, ROPA Z ROPNIA, WYCINKI TKANEK, KREW, KAŁ, MOCZ, POPŁUCZYNY PĘCHERZYKOWO- OSKRZELOWE PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY, WYMAZ ZE SPOJÓWKI, ZESKROBINY ROGÓWKOWE

ZASADY PRZED ROZPOCZĘCIEM CHEMIOTERAPII Z MIEJSC, W KTÓRYCH TOCZY SIĘ PROCES CHOROBOWY W ODPOWIEDNIM CZASIE POBRAĆ ODPOWIEDNIĄ ILOŚĆ/OBJĘTOŚĆ MATERIAŁU ZACHOWAĆ ZASADY ASEPTYKI (SPRZĘT, DEZYNFEKCJA SKÓRY) ZAPEWNIĆ WŁAŚCIWE WARUNKI PRZECHOWYWANIA I TRANSPORTU (TERMICZNE, PODŁOŻA TRANSPORTOWE) DOSTARCZYĆ DO PRACOWNI MIKROBIOLOGICZNEJ W MOŻLIWIE NAJKRÓTSZYM CZASIE

BEZPOŚREDNIE POŚREDNIE METODY BEZPOŚREDNIE POŚREDNIE WYKRYCIE DROBNOUSTROJU WYKRYCIE SWOISTYCH LUB JEGO FRAGMENTU PRZECIWCIAŁ W MATERIALE KLINICZNYM

METODY METODY KONWENCJINALNE (HODOWLA DROBNOUSTROJÓW) METODY NIEHODOWLANE (SZYBKIE TESTY DIAGNOSTYCZNE)

METODY KONWENCJONALNE (HODOWLA) IZOLACJA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJU METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW POŁĄCZONE Z IZOLACJĄ I IDENTYFIKACJĄ MIKROORGANIZMU (NAJCZĘŚCIEJ DO GATUNKU) NAZYWANE SĄ METODAMI KONWENCJONALNYMI (KLASYCZNYMI). SĄ SZCZEGÓLNIE ISTOTNE W BAKTERIOLOGII I MIKOLOGII, GDZIE OPRÓCZ IDENTYFIKACJI CZYNNIKA ETIOLOGICZNEGO POWINNY BYĆ WYKONANE TESTY WRAŻLIWOŚCI NA CHEMIOTERAPEUTYKI/ANTYBIOTYKI.

W POBRANYCH MATERIAŁACH WYSTĘPUJĄ RÓŻNE GATUNKI DROBNOUSTROJÓW, W CELU ICH WYIZOLOWANIA, NAMNOŻENIA I UZYSKANIA CZYSTEJ HODOWLI, PRÓBKI POSIEWA SIĘ NA ODPOWIEDNIE PODŁOŻA WZROSTOWE.

HODOWLA DROBNOUSTROJÓW STWORZYĆ WARUNKI W KTÓRYCH BYTUJĄ DROBNOUSTROJE W A R U N K I H O D O W L I: TLENOWE, MIKROAEROFILNE, BEZTLENOWE TEMPERATURA: 35-37°C, 22-30°C CIŚNIENIE OSMOTYCZNE - IZOTONICZNE STĘŻENIE JONÓW WODOROWYCH (pH) - 6,8 - 7,5 P O D Ł O Ż A (POŻYWKI) H O D O W L A N E PŁYNNE, PÓŁPŁYNNE, STAŁE PROSTE, WZBOGACONE, SPECJALNE , RÓŻNICUJĄCE, WYBIÓRCZE, WYBIÓRCZO - RÓŻNICUJĄCE

IDENTYFIKACJA NA PODSTAWIE CHARAKTERYSTYCZNEGO WZROSTU NA PODŁOŻACH (MORFOLOGII KOLONII) S. aureus Salmonella spp.

MORFOLOGIA KOLONII KSZTAŁT - OKRGŁY, OWALNY, SOCZEWKOWATY, PROMIENISTY WIELKOŚĆ - ŚREDNICA KOLONII [W MM] BRZEG - RÓWNY, FALISTY, POSZARPANY POWIERZCHNIA - GŁADKA, POMARSZCZONA, GRUBOZIARNISTA WYNIOSŁOŚĆ PONAD POWIERZCHNIĘ - PŁASKA, BRAK, STOŻKOWATA KOLOR - KOLONII, PODOŻA PRZEJRZYSTOŚĆ - PRZEJRZYSTA, MĘTNA ZAPACH - DROŻDŻY, MIODU TYP HEMOLIZY - α, β, γ

PRODUKCJA HEMOLIZYN S. pyogenes S. pneumoniae C. perfringens - podwójna hemoliza

WZROST NA PODŁOŻACH PŁYNNYCH WZROST DROBNOUSTROJÓW ZWIĄZANY JEST ZE SPOSOBEM ODDYCHANIA BAKTERII. MOŻE ODBYWAĆ SIĘ NA POWIERZCHNI POŻYWKI, TWORZYĆ OSAD NA DNIE NACZYNIA LUB POWODOWAĆ ZMĘTNIENIE CAŁEJ POŻYWKI

IDENTYFIKACJA (2) NA PODSTAWIE OBRAZU MIKROSKOPOWEGO NA PODSTAWIE WYNIKÓW TESTÓW BIOCHEMICZNYCH (KOMERCYJNE TESTY API) OKREŚLAJĄCYCH ZDOLNOŚĆ DROBNOUSTROJÓW DO NP.: ROZKŁDU CUKRÓW, ALKOHOLI, ICH WŁAŚCIWOŚCI PROTEOLITYCZNE, WYTWARZANIE ENZYMÓW

NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONE SĄ KOMERCYJNE BIOCHEMICZNE TESTY DIAGNOSTYCZNE, NP.: API 20 E - PRZEZNACZONE DLA BAKTERII Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE API 20 A - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH

API 20E

METODY NIEHODOWLANE ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI

METODY NIEHODOWLANE (1) ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE PRECYPITACJI AGLUTYNACJI IMMUNOFLUORESCENCJI, IMMUNOENZYMATYCZNE

ODCZYN PRECYPITACJI ROZPUSZCZALNE ANTYGENY POLIPEPTYDOWE LUB WIELOCUKROWE UZYSKUJE SIĘ Z TKANEK LUB Z DROBNOUSTROJÓW NA DRODZE EKSTRAKCJI KWASAMI, ENZYMATYCZNIE LUB W PODWYŻSZONEJ TEMPERATURZE. DO ICH IDENTYFIKACJI STOSOWANE SĄ W OBECNOŚCI ELEKTROLITÓW ZNANE SWOISTE PRZECIWCIAŁA. ZASTOSOWANIE: OZNACZANIE GRUP SEROLOGICZNYCH PACIORKOWCÓW HEMOLIZUJĄCYCH WG LANCEFIELD (IDENTYFIKACJA WIELOCUKRU C) - PRECYPITACJA OBRĄCZKOWA. IMMUNOPRECYPITACJA (IMMUNODYFUZJA) - METODA ELEKA DO WYKRYWANIA TOKSYNOTWÓRCZOŚCI MACZUGOWCÓW BŁONICY.

AGLUTYNACJA LATEKSOWA MIKROCZĄSTECZKI LATEKSU OPŁASZCZONE SĄ ZNANYMI PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE WIĄŻĄ SIĘ ZE SPECYFICZNYMI ANTYGENAMI, DOPROWADZAJĄC DO WIDOCZNEJ GOŁYM OKIEM AGLUTYNACJI. WYKONANIE TESTÓW NIE WYMAGA UŻYCIA CZYSTYCH SZCZEPÓW DROBNOUSTROJÓW. ZASTOSOWANIE: IDENTYFIKACJA DWOINEK ZAPALENIA PŁUC, DO WYKRYWANIA CZYNNIKÓW ZAPALENIA OPON MÓZGOWO - RDZENIOWYCH (H. INFLUENZAE, S. PNEUMONIAE).

AGLUTYNACJA SZKIEŁKOWA IDENTYFIKACJA NIEZNANYCH SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH, PRZY UŻYCIU ZNANYCH SWOISTYCH SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH. ZASTOSOWANIE: W DIAGNOSTYCE BAKTERII Z RODZAJÓW : SALMONELLA, SHIGELLA, PSEUDOMONAS, NEISSERIA.

Coli Lateks EPEC

METODY IMMUNOFLUORESCENCYJNE ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI BEZPOŚREDNIEJ PO UTRWALENIU PRÓBKI NAKRAPLA SIĘ WZORCOWE PRZECIWCIAŁA WYZNAKOWANE FLUOROCHROMEM. PO OKRESIE INKUBACJI PREPARAT UMIESZCZA SIĘ W MIKROSKOPIE FLUORESCENCYJNYM. JEŚLI W BADANYM MATERIALE ZNAJDOWAŁY SIĘ SPECYFICZNE DLA WYZNAKOWANYCH PRZECIWCIAŁ DROBNOUSTROJE, W POLU WIDZENIA MIKROSKOPU UWIDOCZNI SIĘ ŚWIECĄCY KOMPLEKS.

METODY IMMUNOFLUOROSCENCYJNE ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI POŚREDNIEJ W REAKCJI BIORĄ UDZIAŁ 3 REAGUJĄCE SUBSTANCJE: ZNANY ANTYGEN, BADANA SUROWICA, ZNAKOWANA FLUOROCHROMEM ANTYIMMUNOGLOBULINA ZWIERZĘCA PRZECIW POSZUKIWANYM PRZECIWCIAŁOM.

METODY IMMUNOENZYMATYCZNE (EIA, ELISA) BEZPOŚREDNIE - BADANE ANTYGENY REAGUJĄ Z PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE, ZWIĄZANE SĄ Z ENZYMEM NP.: PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ. DLA UWIDOCZNIENIA KOMPLEKSU ANTYGENU Z PRZECIWCIAŁEM DODAJE SIĘ ODPOWIEDNIO DOBRANY SUBSTRAT I PO INKUBACJI ODCZYTUJE SIĘ WYNIK REAKCJI BARWNEJ JAKOŚCIOWO LUB ILOŚCIOWO.

METODY POŚREDNIE ZASTOSOWANIE: DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ WYWOŁANYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE Z RODZAJU: BORRELIA, LEGIONELLA, CHLAMYDIA.

METODY NIEHODOWLANE (2) METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ POSZUKIWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH W MATERIALE KLINICZNYM LUB HODOWLI DROBNOUSTROJÓW; PCR (METODA POLIMERYZACJI REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ), HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH PRZY UŻYCIU SOND MOLEKULARNYCH

HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH - PRZY UŻYCIU SOND METODA POLIMERAZOWEJ REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ (PCR) POZWALA NA WYKRYCIE ZNIKOMEJ ILOŚCI DNA W BADANEJ PRÓBCE, NAWET GDY DROBNOUSTROJE W MATERIALE ZAKAŹNYM SĄ MARTWE. HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH - PRZY UŻYCIU SOND MOLEKULARNYCH. BADANIE TRWA OK. 2 GODZ. I UMOŻLIWIA W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU DROBNOUSTROJU WYKRYCIE DNA PRZY ILOŚCI 10 3 DROBNOUSTROJÓW.

INNE METODY IDENTYFIKACJI ANALIZA CHROMATOGRAFI GAZOWEJ METODA STOSOWANA JEST DO JAKOŚCIOWEGO LUB ILOŚCIOWEGO ROZDZIAŁU SUBSTANCJI (SKŁADNIKÓW KOMÓREK BAKTERYJNYCH LUB PRODUKTÓW ICH METABOLIZMU) O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ. WYSOCE PRECYZYJNA I CZUŁA. STOSOWANA JEST GŁÓWNIE DO IDENTYFIKACJI PRODUKTÓW METABOLIZMU BAKTERII BEZTLENOWYCH (KWASY TŁUSZCZOWE). POZWALA TEŻ NA SZYBKĄ IDENTYFIKACJĘ GRZYBÓW I BAKTERII Z RODZAJÓW MYCOBACTERIUM, NEISSERIA.

TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI MA NA CELU IDENTYFIKACJĘ OKREŚLONYCH GATUNKÓW WYHODOWANYCH BAKTERII (RZADKO) LUB OZNACZANIE ICH TYPÓW FAGOWYCH. OZNACZANIE TYPÓW FAGOWYCH STOSOWANE JEST W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM, W CELU USTALENIA ŹRÓDŁA ZAKAŻENIA I DRÓG SZERZENIA W ŚRODOWISKU SZPITALNYM I POZASZPITALNYM.

OKREŚLENIE LEKOWRAŻLIWOŚCI POZWALA NA WYBÓR CHEMIOTERAPEUTYKU O NAJWĘŻSZYM ZAKRESIE DZIAŁANIA I NAJWIĘKSZEJ SKUTECZNOŚCI PRZECIWKO WYIZOLOWANEMU DROBNOUSTROJOWI.

DOSTĘPNE SĄ KOMERCYJNE METODY OZNACZANIA LEKOOPORNOŚCI BAKTERII WG SYSTEMU ATB: ATB G - DLA RODZINY ENTEROBACTERIACEAE ATB - STAPH 5 - DLA GRONKOWCÓW ATB - ANA - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI BAKTERII NA LEKI - TESTY SPECJALNE

METODA DYFUZYJNO - KRĄŻKOWA

Aglutynacja lateksowa WYKRYWANIE BIAŁKA PBP 2’ - IDENTYFIKACJA GRONKOWCÓW OPORNYCH NA METYCYLINĘ (MRSA, MRCNS)

P O D R Ę C Z N I K I