Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie 2005/2006

Zgony z powodu głównych chorób infekcyjnych (dane globalne) zgony (mln) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 inf.oddech. AIDS biegunki TB malaria odra wiek < 5 lat wiek > 5 lat (wg. WHO Report on Infectious Diseases 1999)

Gruźlica na świecie Na świecie prątkiem gruźlicy zakażonych jest 1,9 mld osób (1/3 światowej populacji) Rocznie na gruźlicę zapada 7 - 8 mln osób, w tym 1,5 mln dzieci Rocznie na gruźlicę umiera 2 mln osób, w tym 100 tys. Dzieci 95% nowych zachorowań oraz 80% zgonów z powodu gruźlicy dotyczy krajów ubogich W krajach rozwijających się 80% chorych na gruźlicę to osoby w wieku produkcyjnym Szacuje się, że nieleczony chory zakaża 10 - 15 osób w ciągu roku Problemem globalnym jest gruźlica wielolekooporna (Raporty WHO)

80 % zachorowań na gruźlicę dotyczy 22 krajów świata

TB notification rate, 2003 TB notification rates, 2003 0-24 25-49 50-99 100 or more No report The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

Estimated TB incidence rate, 2003 Rates per 100 000, all forms of TB 0 - 24 25 - 49 50 - 99 100 - 299 300 or more No estimate The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

Wsp. zachorowań na gruźlicę - dane przybliżone - 2000 r. 600 500 400 300 200 100 Chiny Indie Peru Polska Rosja Nigeria Kongo Kamb. Brazylia Etiopia Filipiny Uganda Tajlandia Indonezja Afganistan Pol.Afryka Zimbabwe

Polska - zapadalność na gruźlicę - 2005 r. Nowo zarejestrowanych chorych 9 280 (wsp. 24,9) (wszystkie postacie gruźlicy, w tym 260 więźniów,17 cudzoziedmców) kobiety 3 200 (wsp. 16,2) mężczyźni 5 509 (wsp. 32,9) miasta 6 279 wieś 3 771 Nowe zachorowania 8 203 (wsp. 21,5) Wznowy 1 077 (wsp. 2,8)

Polska – umieralność z powodu gruźlicy 2004 r. Gruźlica jako przyczyna zgonu - 813 osób Gruźlica układu oddechowego - 786 osób Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 0,2 % ogółu zgonów Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 37,8% zgonów z powodu wszystkich chorób zakaźnych i pasożytniczych

Polska –2005 r. 91,2 % wszystkich zachorowań stanowiła gruźlica płuc 8 459 przypadków (w tym 3 258 AFB+) Lokalizacja pozapłucna 821 przypadków (8,8 % nowo zarejestrowanych) 52 przypadki gruźlicy pozapłucnej z jednoczesną gruźlicą płuc inne lokalizacje to gruźlica: opłucnej 351 przypadków narządów moczowo-płciowych 111przypadków obwodowych węzłów chłonnych 143 przypadków kości i stawów 87 przypadków gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych 19 przypadków (w tym 2 dzieci z woj. mazowieckiego)

Struktura zachorowań na gruźlicę płuc w Polsce (2005 r.) naciekowa 87,2% serowate zapal. 1,9% pozaplucna 8,8 % włóknisto-jamista 1,5%

Polska-zachorowania na wszystkie postacie gruźlicy r. 0-14 lat wsp. 1,6 >65 lat wsp. 50,3 0-14 wsp. /100 000 mieszk. 15-19 20-44 45-64 65+ 100 80 65 + 60 45 - 64 40 20 - 44 20 15 - 19 0 - 14 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001

Gruźlica – zachorowania / 100 000 mieszkańców wsp. 80 60 Polska Wegry 40 Slowacja 20 Rep.Czeska Niemcy 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 ( wg: WHO Raport 2002 - Global Tuberculosis Control)

Gruźlica – zachorowania / 100 000 mieszkańców wsp. 140 120 100 Rumunia 80 Lotwa 60 Rosja 40 Bialorus 20 Ukraina 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 ( wg: WHO Raport 2002 - Global Tuberculosis Control)

Strategia DOTS: Instytucjonalny nadzór rządowy zwalczania gruźlicy 2. Zgłaszanie przypadków bk(+) rej.służbom epidemiol. 3. Nieprzerwane 6-8 miesięczne leczenie 4. Standardowy system rejestracji i sprawozdawczości

(Polska 1996-1997, pozostałe kraje 1994-1997) Lekooporność wśród chorych na gruźlicę w Polsce w porównaniu z innymi krajami świata pierwotna nabyta Rep.Czeska Polska Francja USA Portugalia Rosja Estonia Litwa 20 40 60 80 100 120 120 100 80 60 na 1 lek i więcej 40 20 USA Rosja Litwa MDR Polska Francja Estonia Rep.Czeska Portugalia     Na podstawie: N Eng J Med. 1998,338,1641 Pneumonol Alergol Pol 1999,11-12,536 (Polska 1996-1997, pozostałe kraje 1994-1997)

Wzrost oporności na leki wśród szczepów Mycobacterium tuberculosis Polska 1997 2000 Oporność ogółem (nowe zach.) 3,6 % 6,12% p<0,001 Oporność wielolekowa pierwotna 0,6% 1,15% p<0,001 Oporność na 4 leki 0,0% 0,5%*/ p<0,001 (INH+RMP+SM+EMB) Oporność wielolekowa wtórna 7,0 % 8,55% n.s. */ 15 chorych (wg. Augustynowicz i wsp. Zakażenia 1,2003) Badanie na ok. 1000 szczepów gruźlicy wtórnej i ok. 3000 pierwotnej

Laboratoryjna Diagnostyka Gruźlicy

Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej w 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych chorych (9 280) jedynie u 5 409 potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 6

Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: * niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach * koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia (mikroskopia, techniki hodowlane,techniki biologii molekularnej) Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka. gruźlicy obejmuje Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje (i) bakterioskopię oraz metody molekularne (ii) wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji wzrostu prątków (iii) określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody biochemiczno- mikrobiologiczne metody molekularne (PCR, sondy genetyczne) analiza kwasów mikolowych techniką HPLC (iv) określenie lekowrażliwości

Miarą nowoczesności laboratorium. diagnostyki gruźlicy jest spełnienie Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie Docelowo powinno dążyć się do skrócenia czasu diagnostyki do < 25 dni

Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

B a k t e r i o s k o p i a (+) (-) (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Czas wykonania około 3 godzin Niska cena badania Nie różnicuje prątków żywych i martwych Nie różnicuje gatunku prątków Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

Mycobacterium sp. barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie (1999-2005) mykobakteriozy n = 9 (7%) TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB

obecność prątków wynik     O 1-2 / 300 pól widzenia 1-9 / 100 pól widzenia 1-9 / 10 pól widzenia 1-9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek + (sporadyczne) ++ (nieliczne) +++ (średnio liczna) ++++ (liczne) obecność prątków wynik */ przy powiększeniu 800 x - 1000x   (

(+) (-) (+) (-) H o d o w l e Czas hodowli do 8-10 tygodni Czułość - około 70 % Potwierdzenie obecności żywych prątków Pozyskanie szczepu do typowania gatunku Możliwość określenia lekoporności H o d o w l e Pożywka Loewensteina-Jensena Pożywki płynne (+) (-) (+) (-) Czas hodowli do 8-10 tygodni Niska cena badania Hodowla kilku -dniowa Wymogi sprzętowe

Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych *radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc /MOTT) *kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation), (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) *system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze)

Identyfikacja gatunku prątków W większości laboratoriów wykonuje się jedynie test niacynowy

kwas mykolowy galaktan arabinian łącznik peptydoglikan

HPLC (high pressure liquid chromatography)   HPLC (high pressure liquid chromatography) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa Analiza składu kwasów mykolowych: Hydroliza Ekstrakcja chloroformem Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej Wzór elucyjny badanej próby Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC M.tuberculosis LMW HMW M.avium LMW HMW M.interjectum LMW HMW

Metody biologii molekularnej (+) (-) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około 70 - 90 % Swoistość 97-100 % Wykrywanie zakażeń w bardzo wczesnej fazie Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: M.tbc complex, M.avium, M.intracellulare, M.konsasii, M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

zanieczyszczenia środowiskowe lub kolonizacja Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie (1999-2005) mykobakteriozy n = 22 (11%) TB n = 113 (36%) NTM n = 199 (64%) NTM zanieczyszczenia środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) potwierdzenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MT

chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik liczba chorych Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik liczba chorych AFB (+) hodowla (+) 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9 * ogółem 142 w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny We have owns 7-year experience with MTB test. Among 142 TB patients as many as 29 cases were recognized as M.tbc infected only by molecular test. 9 patients were AFB and culture negative. 20 patients were microscopically positive. But I would like to point out 9 of 51 culture posiive and simultaneously MTB negative from this same specimen We think that it is effect of different volumes of sample used in both tests and may be not enough homogenisity of samples. But fact is fact * dodatni test molekularny(MTB)

Systemy molekularne w diagnostyce gruźlicy * Amplicor MTB (Roche Molecular System, Somerville, New Jersey) - w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex PCR * Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) test (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) – w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA * BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification); (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) - rozpoznaje M.tbc complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA

Wykrycie produktów reakcji Amplicor MTB PCR (Roche) Próbka kliniczna Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA PCR Wykrycie produktów reakcji 103 - 10 4 101 - 10 2

Mycobacterium tuberculosis complex : Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium africanum Mycobacterium microti Do niedawna nierozróżnialne metodami biologii molekularnej dopuszczonymi do diagnostyki rutynowej

Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy metody molekularne hodowle mikroskopia 70 – 90 % kilka godz. 70 % kilka dni - 8 tygodni 30 % 3 godz.

bk - próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) metoda molekularna bakterioskopia hodowla wynik bk - Tbc nie Tbc bk+ 24 h ujemna dodatnia test niacynowy lub metody molekularne M.kansasii MAC M.tuberculosis HPLC wynik kilkadziesiąt gatunków prątków M.tuberculosis kilkanaście dni do 10 tyg. wynik lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilka godzin do 40 dni

Najczęstsze błędy laboratoryjne lub interpretacyjne w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy Jednoznaczna interpretacja mikroskopii bk (+) jako gruźlicy, może być to: * gruźlica * saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) * mykobakterioza * w przypadku materiałów bronchoskop., zanieczyszczenie instrumentarium

II Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: * diagnozowanie mykobakterioz * wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi

Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

IV    Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego

Immunologiczna diagnostyka zakażenia M Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI

Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis cell mediated immunity nasilenie odpowiedzi przeciwciała replikacja prątków L a t e n t TB I n f e c t i o n czas choroba zakażenie

skórny test tuberkulinowy Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

pomiar testu tuberkulinowego IFN-γ test skórny IL- 8 TNF- komórka pamięci komórka prezentująca antygen IFN-γ TNF- IL- 8 krew - test in vitro pomiar produkcji IFN-γ

Czynniki negatywizujące TST: Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja Zła technika szczepienia Zła technika odczytu

ekspozycja na M.tbc gruźlica 5 -10 % brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5 -10 % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% wg E.Tortoli 2005

Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis Antygen NTM Antygen ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 CFP-10 M abscessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M tuberculosis +   + M fortuitum - - M gordonae - - BCG M intracellulare - - moreau - - M kansasii + + pasteur - - M malmoense - - M marinum + + tokyo - - M genavense - - danish - - M scrofulaceum - - glaxo - - M smegmatis - - montreal - - M szulgai + + M terrae - - - M vaccae - - M xenopi - -

QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

Quantiferon metoda probówkowa 1 krew inkubacja 16 - 24h w 37°C kontrola ESAT6 + CFP10 mitogen ujemna wirowanie kolor 2 DO 450nm badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny IFN-g IU/ml odczytanie stężenia z krzywej standardowej

Quantiferon – metoda płytkowa ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi krew + antygeny inkubacja 24h , wydzielenie IFN-γ KOLOR DO 450nm IFN-g IU/ml ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej

QuantiFERONTB Gold – interpretacja wyników miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K wynik interpretacja  0,5  0,35 pozytywny zakażenie prawdopodobne < 0,5 < 0,35 negatywny nieprawdopodobne nieokreślony brak wyniku IU IFN- γ /ml

T SPOT- TB assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ kontrola ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi separacja leukocytów jednojądrzastych inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ kOLOR ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) inkubacja 24 h w 37oC ocena liczby barwnych plamek

Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany

T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004) cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004) Figure 1. Dot plot of individual responses to CFP-10 and ESAT-6 for 118 culture-positive patients with tuberculosis (TB) (a), 213 subjects with a low risk for TB exposure (b), and 33 TB suspects whose TB status could not be determined, as Mycobacterium tuberculosis could not be cultured (c). *For "ESAT/CFP" the data for the antigen (ESAT-6 or CFP-10) giving the highest response is shown. The dashed line represents the cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ

ekspozycja na M.tbc gruźlica 5 - 10 % brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5 - 10 % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% wg E.Tortoli 2005

QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum. Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (LTBI). CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

Schemat reakcji PCR DNA wyjściowe 1.Denaturacja termiczna 2.Przyłączanie primerów 3.Synteza nowej nici DNA (termostabilna polimeraza)

wydłużanie (synteza) nowej nici DNA przyłączanie primerów PCR –Polymerase Chain Reaction Polimerazowa reakcja łańcuchowa *Powielenie wybranego fragmentu DNA w cyklicznej reakcji z wykorzystaniem primerów obejmujących (flanklujących) interesującą sekwencję * Każdy cykl reakcji składa się z trzech etapów sterowanych zmianami temperatury: wydłużanie (synteza) nowej nici DNA denaturacja przyłączanie primerów 94-95oC 15 sek–1,5min 72oC 30 sek–3min 40-60oC 30 sek–2 min *liczba cykli 20 – 40 teoretyczna liczba kopii DNA uzysklanych w reakcji PCR z 1 wyjściowej cząstki DNA = 2n (n-liczba cykli)

Wizualizacja wyników testu Amplicor - MTB opiera się na technice ELISA przy użyciu: biotynylowanych primerów w reakcji PCR sondy genetycznej wiążącej swoiste DNA konjugatu awidyna - peroksydaza substratu tetrametylobenzydyny –TMB czas wykonania – 5-8 godzin

rRNA Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe) promotor-primer RT - odwrotna transkrypcja  rRNA/DNA rRNA rRNADNA degradacja rRNA przez RNA-zęH, RT,  DNA/DNA primer 2 polimeraza RNA tworzy kopie RNA na matrycy DNA 100 -1000 kopii primer 2 promotor-primer RT RNA/DNA,degradacja rRNA,synteza nowej nici DNA,powrótdupleksu do cyklu

Wizualizacja testu Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe) opiera się na: * stosowaniu sond DNA znakowanych estrem akrydyny, które wiążą amplikony RNA * odrzuceniu sond niezwiązanych z RNA * odczycie wyników w luminometrze * Czas wykonanie – 6-8 godzin

SDA - Strand Displacement Amplification Amplifikacja z przemieszczeniem łańcucha BDProbe Tec ET 2 5' 1 5' 5' 5' 1- DNA prątkowe 2-primer swoisty dla poszukiwanego DNA zawiera nukleotyd z siarką swoisty dla endonukleazy BsoB1 3- Duplex DNA (polimeraza Bst) 4- Endonukleaza BsoB1 tnie swoistą sekwencję. Ciecie nie jest efektywne (siarka!) 5- miejsce cięcia naprawia polimeraza DNA (Bst) 3 4 5 Efektywność amplifikacji – 109 kopii sekwencji swoistej

BD Prob Tec ET(c.d.) Detekcja produktów amplifikacji w teście odbywa się na zasadzie fluorescencji Zaletą systemu jest, że amplifikacja i detekcja (na zasadzie fluorescencji) odbywa się w stałej temperaturze * System ma wewnętrzną kontrolę pozytywną * Całkowity czas wykonania testu wynosi około 140 min. * Czułość 9 CFU/reakcję (125 CFU/ml) DNA swoiste separacja przestrzenna F1 i F2 emisja promieniowania czytnik przy braku wiązania ze swoistym DNA sygnał pobudzający F1 przenoszony jest na F2 (ET), który emituje światło o długości fali nie wykrywanej przez czytnik F1 F2 sonda

Amplicor MTB W badaniu 900 próbek klinicznych, w których uzyskano wynik ujemny w badaniu molekularnym (PCR-MTB), w 12 przypadkach (1,7 %) uzyskano wzrost prątków M.tuberculosis w hodowli na pożywce L-J 12 przypadków gruźlicy / 900 wyników PCR (-) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec 1999 - wrzesień 2003

PCR (+) hod. (+) 66% hod. (-) 34% 62 % bk (+) 19 % bk (+) Porównanie czułości: - met. molekularna (PCR-MTB-Roche) - hodowla - bakterioskopia plwociny popł.oskrzelowe płyny BAL wymazy z ran płyny opłucnowe 120 PCR (+) 100 hod. (+) 66% 80 60 hod. (-) 34% 62 % bk (+) 40 19 % bk (+) 20 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec 1999 - wrzesień 2003

czułość i swoistość testów molekularnych w diagnostyce gruźlicy czułość */ swoistość*/ 70 – 90 % 97 – 100 % */ w odniesieniu do hodowli dodatnich