Podsumowanie – wykład 4 Metoda amplifikacji 3’i 5’ końców cDNA (RACE PCR) Wektory plazmidowe do klonowania – test selekscyjny białych i niebieskich kolonii bakteryjnych Metody analizy ekspresji pojedynczych genów i całych transkryptomów Northern- blot Technika ochrony przed aktywnością RN-azy (RPA) Półilościowy RT-PCR (warunki reakcji, zasada amplifikacji) Real Time PCR (warunki i zasada amplifikacji) Analiza mikromacierzy DNA Sposoby wyciszania genów (nokautowanie, iRNA, siRNA) – przykład wyciszania genu kodującego syntazę chalkonową CHS u roślin z rodziny goryczkowatych i petuni.

RACE –Rapid Amplification of cDNA Ends Gene Racer TM RACE Ready cDNA Kit Manual (Invitrogen) Technika szybkiej amplifikacji 3’ i 5’ końców cDNA (RLM-RACE) Charakterystyka regionów promotorowych Otrzymywanie kompletnej sekwencji cDNA 5’ 3’ 1 3175 pz. 3175-1359=1816 1602 214

Schemat dobudowywania końców 3’ i 5’ do znanego fragmentu genu ATG Gene Racer Oligo RNA gen pompy protonowej 1359pz. GeneRacerOligo dT-3’ GenePacer 5’PRIMER GeneRacer 3’PRIMER GSP for GSP rev 1602 214 Dołączenie oligo(dT) przy użyciu terminalnej transferazy do końca 3’ Reakcja PCR z użyciem GSP (gene specific primer) i primera komplementarnego do linkera oligo dT (Gene Race 3’ Primer) Przyłączenie „adaptera” oligo RNA na 5’ Wzmocnienie swoistości amplifikacji przez PCR ze starterami swoistymi do kolejnych bardziej wewnętrznych regionów DNA („nested” PCR)

Zakotwiczony PCR – nested PCR „Zakotwiczony” PCR podnosi specyficzność i intensywność produktów RACE dla 5’ i 3’ końców badanego genu Stosowany wówczas gdy otrzymujemy wiele transkryptów różnej wielkości lub „smary” po reakcji PCR matrycą jest cDNA otrzymany po pierwszej reakcji PCR startery typu „nested” dla 3’ i 5’ -specyficzne -Gene Racer

Białe i niebieskie kolonie bakteryjne Wykrywanie zrekombinowanych plazmidów Gen LacZ kodujący b-galaktozydazę pod kontrolą promotora lac W szczepie bakterii E. coli z represorem lac ekspresję genu lac indukuje się podając IPTG- izopropylo-beta –D- tiogalaktopiranozyd Aktywna beta-galaktozydaza rozkłada substrat X-Gal (5-bromo-4chloro-3 indolilo-β-D-tiogalaktopiranozyd) prowadząc do powstania niebieskiego produktu Insercja w genie lacZ prowadzi do inaktywacji enzymu stąd biała barwa kolonii.

PCR w czasie rzeczywistym (real time pcr) Termocykler sprzężony z fluorymetrem, który umożliwia pomiar fluorescencji w trakcie trwania reakcji PCR PCR z jednoczesną analizą przyrostu ilości produktu na podstawie fluorescencji - wykrywanie produktu we wczesnych fazach reakcji -monitorowanie kinetyki reakcji PCR w trakcie jej trwania Ilość produktu po zakończonej reakcji powinna być proporcjonalna (wykładniczo) do początkowej puli cDNA Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do liczy namnożonych cząsteczek DNA

Porównanie ekspresji metodą mikromacierzy Izolacja RNA-- odwrotna transkrypcja--cDNA (wyznakowany barwnikiem fluorescencyjnym) -barwnik czerwony (Cy5) -barwnik zielony (Cy3) Wymieszanie obu próbek cDNA Hybrydyzacja z sondami w każdej plamce mikromacierzy Wzbudzenie przez światło lasera – „plamka” będzie fluoryzować na czerwono jeśli -związała więcej czerwonego barwnika = nadekspresja genu w chorej tkance; odwrotnie plamka będzie fluoryzować na zielono jeśli ekspresja ulega obniżeniu w chorej tkance w porównaniu z tkanką prawidłową. http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM&feature=related

Nokautowanie RNA – iRNA, siRNA Wprowadzenie różnego typu dwuniciowych RNA (iRNA, siRNA) do komórki prowadzi do degradacji transkryptów mRNA – wydajna metoda do wyłączania (nokautowania genu) w celu eliminacji jego funkcji; Wprowadzenie dodatkowych kopii genu kodującego syntazę chalkonową nadającą płatkom petunii fioletową barwę zamiast nasycać barwą spowodowało,że stały się one miejscami białe. Wyciszenie genu syntazy chalkonowej przy użyciu iRNA u gatunków Gentiana triflora (goryczkowate) powoduje białe zabarwienie płatków