Podsumowanie – wykład 3 1. Technologia DNA Enzymy restrykcyjne – endonukleazy Trawienie restrykcyjne i ligacja DNA Topoizomeraza I Enzymatyczna metoda sekwencjonowania (Metoda Sangera) 2. Metoda PCR Etapy reakcji Warunki reakcji ( startery, polimeraza Taq) Startery specyficzne i zdegenerowane Typy polimeraz Zastosowanie PCR 3. Przykłady modyfikacji PCR RT-PCR Multipleks PCR Odwrotny PCR Real Time PCR RACE PCR

Nukleazy restrykcyjne - endonukleazy enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań fosfodiestrowych: tworząc końce 3’OH i 5’PO4 rozcinają DNA tylko w miejscach, określonych przez krótkie sekwencje nukleotydów (od 4-8 par nukleotydów);sekwencje palindromowe; rożne szczepy bakterii zawierają różne nukleazy restrykcyjne- mechanizm obronny przed obcym DNA; Nukleazy restrykcyjne Nukleazy restrykcyjne wykorzystywane w technologii DNA pochodzą z bakterii; przeciętny katalog handlowy wymienia ponad 100 restryktaz, z których każda rozcina inną sekwencję DNA. Określony enzym restrykcyjny zawsze rozcina daną cząsteczkę DNA w tym samym miejscu. Tak więc próbka DNA poddana działaniu n.r. zawsze daje ten sam zestaw fragmentów DNA. Endonukleazy restrykcyjne stanowią mechanizm obronny u bakterii skierowany przeciwko obcemu DNA; DNA gospodarza jest chronione dzięki metylacji zasad A lub C w obrębie tej samej sekwencji, którą rozpoznaje dana endonukleaza. Dzięki zastosowaniu endonukleaz i rozdzielaniu tych fragmentów było możliwe konstruowanie fizycznych map niewielkich regionów DNA- określało się miejsca rozpoznawania przez nukleazy- tzw. Mapy restrykcyjne Produkty trawienia restrykcyjnego, które posiadają tzw. lepkie końce mogą łączyć się przez oddziaływania między parami zasad jednoniciowych krótkich fragmentów z końcami innych fragmentów DNA mających taką samą wystającą sekwencję. Nukleazy mogą też generować powstawanie tępych końców, które nie będą się łączyły. „tępe końce” „lepkie końce” Nazwy enzymów pochodzą od gatunków, z których zostały wyizolowane po raz pierwszy np. Heamophilus influanzae szczep Rd (Hind III) III- trzecia endonukleaza

Topoizomeraza I Topoizomeraza I Topoizomeraza I – pochodzi z wirusa Vaccinia ; pełni jednocześnie fukncję endonukleazy i ligazy DNA rozpoznaje specyficzną sekwencję pentamerową 5’-(C/T)CCTT-3’ w naturze enzym ten uwalnia tzw. superskręty w dsDNA systemy komercyjne z liniowymi wektorami zawierają topoimomerazę I przyłączoną do końca 3’ wektora, co ułatwia ligację i czyni ją bardziej efektywną ( 95 % w porównaniu do 60% z użyciem ligaz) Topoizomeraza I

PCR Etapy reakcji PCR Wstępna denaturacja ( 3min w 94°C) 25-35 cykli, każdy składa się z: Denaturacji 95°C 1 min Hybrydyzacji 50-60°C 30”-1min Elongacji (syntezy) 72°C 1-2 min Koniec reakcji – obniżenie temperatury do 4°C

MODYFIKACJE REAKCJI PCR RT-PCR – matrycą jest cDNA syntetyzowane z użyciem odwrotnej transkryptazy na bazie mRNA Multiplex PCR – umożliwia jednoczesne amplifikowanie kilku genów, konieczne jest dodanie do mieszaniny reakcyjnej kilku par starterów, produkty o różnej długości łatwo rozdzielić podczas elektroforezy – test do wykrycia mikroorganizmów w wodzie i pożywieniu Odwrotny PCR (inverse PCR)- amplifikacja fragmentów oskrzydlających z obu stron odcinek DNA; Real Time-PCR – ilościowy PCR, PCR z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym, umożliwia monitorowanie przebiegu reakcji PCR poprzez okreslanie ilosci powstajacego produktu w każdym cyklu z użyciem znaczników fluorescencyjnych np. SYBR-Green I RACE PCR-(Rapid Amplification cDNA-Ends)- amplifikacja 3’ i 5’ końców cDNA znanego fragmentu mRNA Odwrotny PCR- jeżeli genomowy DNA został trawiony enzymami restrykcyjnymi, a następnie fragmenty zostały zligowane do formy kolistej to można zastosować startery o odwrotnej orientacji to tych, które amplifikowały znany fragment. Otrzymamy w ten sposób amplifikację fragmentów oskrzydlających z obu stron znany odcinek DNA.

Projektowanie starterów OBLICZANIE TEMPERATURY HYBRYDYZACJI 1. Zasada: 2 + 4 2°C x (A+T) + 4°C x (C+G) TACCTAGGTTGACCATCTACTAA TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 9 G+C TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 14 A+T Tm = 2°C x (14) + 4°C x (9) Tm = 28°C + 36°C = 64°C 2. Kalkulator http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer

Kalkulator OligoAnalyzer 3.1

POLIMERAZY TAQ i PFU Syntezę DNA prowadzają polimerazy DNA najczęściej pochodzące z termostabilnych bakterii Bakterie Thermus aquaticus odkryto w 1969 roku w gorących źródłach Polimerazę DNA Taq wyizolowano z tych bakterii w 1976; maksymalna aktywność w temp. 70-80°C, optimum: 72°C ; popełnia błąd średnio co 250 nukleotydów nie posiada aktywności naprawczej 3’-5’ egzonukleazy Okres półtrwania ponad 2 h (w 95° C) Polimeraza Pfu –polimeraza pochodząca z Pyrococcus furiosus, posiada aktywność korekcyjną egzonukleazy i dzięki temu wykazuje zredukowany wskaźnik błędów.