Cytometria przepływowa

FACS – Fluorescence activated cell sorting

FacsCalibur Producent – Becton Dickinson Rok produkcji 2010 System akwizycji danych rejestruje komórki lub cząstki biologiczne przepływające z częstością > 3000 na sek.

FacsCalibur Model dwulaserowy: laser argonowy – 488 nm laser diodowy – 635 nm Czterokolorowy czyli 4 fluorescencje: FL1, FL2, FL3 i FL 4

Budowa Układ ciśnieniowo-cieczowy (pompa, zbiorniki, filtry) – zapewnia przepływ próbki przez aparat Układ optyczny (laser, pryzmaty, soczewki, filtry) – wzbudzanie i detekcja sygnałów z fluorochromów Układ elektroniczny (detektory, wzmacniacze) – przetwarzanie i obrazowanie danych

Układ ciśnieniowo-cieczowy zawiesina komórek ciecz osłaniająca fluorescencja promień lasera wg Purdue University Cytometry Laboratories 7

Układ optyczny Zadania: Wzbudzanie fluorochromów (barwników) Detekcja sygnałów z fluorochromów na odpowiednich fotopowielaczach(detektorach)

Układ elektroniczny Zadania: - Przekazanie sygnału z detektorów do komputera. - Przetworzenie informacji na dane graficzne i statystyczne

Analiza cytometryczna określa: Względną wielkość komórek oraz ich wewnętrzne zróżnicowanie Badanie struktur komórkowych wyznakowanych odpowiednimi układami przeciwciało-barwnik

Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni Właściwości FSC i SSC Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni Detektor rozproszenia na wprost Laser Rozproszenie na wprost FSC mierzone wzdłuż osi padającego światła lasera określa wielkość komórki Rozproszenie boczne SSC mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej światło laserowe odbite i rozproszone określa gęstość i liczbę ziarnistości 11

Analiza wieloparametrowa Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: jednowymiarowe dwuwymiarowe perspektywiczne

Wykres jednowymiarowy – histogram - analizuje intensywność fluorescencji jednego parametru

Wykres dwuwymiarowy - kropkowy, gęstości (każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę) - analizuje intensywność fluorescencji dwóch parametrów

Wykres perspektywiczny (trójwymiarowy)

Parametry mierzone cytometrem przepływowym Strukturalne rozmiar kształt cytoplazmatyczne ziarnistości zawartość barwnika np. hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny aminokwasy fluoryzujące w białkach np. tryptofan, tyrozyna zawartość DNA, RNA, białek, lipidów, cukrów, powierzchniowych antygenów

Parametry mierzone cytometrem przepływowym Funkcjonalne ładunek powierzchniowy ekspresję receptorów powierzchniowych integralność błony (żywotność - apoptoza) aktywność enzymów np. MPO

Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej Diagnostyka immunologiczna niedobory odporności – pierwotne i wtórne diagnostyka alergii in vitro diagnostyka schorzeń autoimmunologicznych transplantologia narządowa i komórkowa ocena subpopulacji limfocytów ocena stanu funkcjonalnego komórek

Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej Diagnostyka hematologiczna Diagnostyka onkohematologiczna fenotypowanie komórek białaczkowych i chłoniakowych analiza profilu DNA komórek nowotworowych – w trakcie chemioterapii wykrywanie choroby resztkowej

Zalety Jednoczesny pomiar wielu elementów tzw. „multiplexing” pojedynczych komórek Analiza populacji na zasadzie cell-by-cell Badanie całych komórek, jąder, mikrofragmentów komórkowych Materiał badawczy – krew obwodowa, szpik kostny, węzeł chłonny, PMR, BAL, fragment tkanki Oszczędność materiału Analiza dużej populacji komórek (dane zbierane co najmniej dla 10.000 komórek na próbkę) Krótki czas analizy Zastosowanie do analizy o różnym charakterze (diagnozowanie choroby, monitorowanie terapii)