Świat małych RNA www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0210

Czym są małe RNA? Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o długości 21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie genów (gene silencing) Małe RNA przyczyniają się do potranskrypcyjnego wyciszania genów (post-transcriptional gene silencing-PTGS) poprzez negatywne działanie na translację lub stabilność mRNA Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego wyciszania genów (transcriptional gene silencing-TGS) poprzez epigenetyczne modyfikacje chromatyny AAAAA RNA Pol Modyfikacje histonów, metylacja DNA The red symbol represents the small RNA. The green symbol with the AAAAA indicates an mRNA. The drawing on the bottom represents double stranded DNA being transcribed by RNA Polymerase to produce a transcript. Association of a small RNA with this transcript helps to target the enzymes that covalently modify chromatin (histone modifying enzymes and DNA methyltransferases) to confer silencing.

Podstawa wyciszania przez RNA – białka Dicer i Argonaute Wyciszanie przez RNA opiera się na dwóch podstawowych reakcjach: a) Dwuniciowy RNA (dsRNA) jest rozcinany przez Dicer i jego homologi na krótkie dwuniciowe RNA. b) Te małe RNA asocjują następnie z białkami rodziny ARGONAUTE i powodują wyciszenie. DICER AGO Silencing The Dicer or (in plants) Dicer-like enzymes cleave dsRNA. Small RNAs associate with ARGONAUTEs (AGOs) to target them to their targets.

Dicer i białka podobne do Dicer W biogenezie siRNA i miRNA, Dicer lub białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL proteins) rozcinają dsRNA lub RNA ze spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt. Note the two strands of the RNA molecule. The cleavage sites are indicated by yellow arrows. Struktura Dicer’a pozwala mu „mierzyć” RNA, który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący marchewkę, Dicer tnie RNA na równe fragmenty. From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi

Mutant Arabidopsis ago1 i ośmiornica Argonauta argo Białka Argonaute Mutant Arabidopsis ago1 i ośmiornica Argonauta argo Białka ARGONAUTE nazwano tak ze względu na wygląd mutanta Arabidopsis argonaute1 ; ago1 ma promieniście rozłożone liście przez co przypomina ośmiornicę o nazwie Argonauta. Białka ARGONAUTE wiążą małe RNA i ich cele http://youdpreferanargonaute.com/2009/06/ Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.

Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny DCL MIR gene RNA Pol AAAn AGO MicroRNA – działa poprzez wyciszanie mRNA i represję translacji mRNA siRNA- działa poprzez potranskrypcyjne i transkrypcyjne wyciszanie genów MicroRNAs are encoded by MIR genes, fold into hairpin structures that are recognized and cleaved by DCL (Dicer-like) proteins.

siRNA – Ochrona genomu siRNA chronią genom poprzez: Supresję atakujących komórkę wirusów Wyciszanie źródeł wadliwych transkryptów Wyciszanie transpozonów i elementów powtarzających się Oprócz tego, siRNA utrzymują niektóre geny w stanie epigenetycznie wyciszonym This image shows the hypersensitive response in a virus-infected tobacco leaf. siRNAs contribute to viral gene silencing. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001) Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: 848-853. Copyright 2001.

Wyciszanie genów indukowane przez wirusy – obraz ogólny AGO Większość wirusów roślin to RNA wirusy, które replikują się poprzez dwuniciowe formy pośrednie. DCL Wirusowy ssRNA Wirusowy dsRNA Kodowana przez wirusa RNA-zależna RNA polimeraza Dwuniciowy RNA jest rozcinany przez DCL wytwarzając siRNA, które asocjują z AGO wyciszając replikację mi ekspresję wirusa.

Rośliny mogą obronić się przed infekcją wirusem i nabyć oporności Najstarsze Najmłodsze Inokulacja wirusem Młodsze liście wytwarzane przez roślinę zakażoną wirusem mogą być pozbawione infekcji, co wskazuje, że rosnąca roślina obroniła się przed infekcją. The next six slides represent a key experiment in the elucidation of the roles of siRNAs in silencing viruses.

Małe RNA korelują z indukowanym przez infekcję wirusem wyciszeniem genów Mały RNA homologiczny do wirusowego RNA występuje w liściachinokulowanych i odległych młodych liściach (systemic leaf), ale nie w liściach inokulowanych roztworem bez wirusa (mock), Inokulowany liść Młody liść (syst.leaf) Dni po inokulacji This very important figure shows the presence of a small RNA in both the viral inoculated leaf (blue box) but also in the distant leaf that was not inoculated with the virus. The experiment shows that a small RNA homologous to the virus (the blot detects complementary sequences to the viral RNA sequences) correlated with silencing both locally and systemically. From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558–1560. Reprinted with permission from AAAS.

Infekcja wirusem powoduje systemiczną akumulację siRNA DCL Liść inokulowany Odległy liść AGO This figure shows that the siRNA is produced in infected tissues and in present in distal tissues. How does the siRNA get to the distal tissues? This question is addressed in the next few slides.

Wyciszenie może się rozprzestrzeniać systemicznie poprzez floem Inokulowany liść Systemiczne wyciszenie Sygnałem systemicznym może być siRNA, jednak dotąd nikt tego nie udowodnił. Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright 1997. Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: 553.

Wyciszanie systemiczne może być zwiększone poprzez amplifikację sygnału DCL Wtórny siRNA RdRP Pierwotny siRNA Wyciszenie może się rozprzestrzenic poza miejsce produkcji wirusa poprzez wtórny siRNA. Jego powstanie wymaga działania RNA-zależnej RNA polimerazy (RdRP). The use of mutants that interfere with siRNA production and amplification have demonstrated that these steps are necessary for systemic silencing. Amplification of the primary siRNA signal by RNA-dependent RNA polymerase is particularly important in the signal amplification and movement.

Mutanty w wytwarzaniu siRNA są bardziej podatne na infekcje wirusowe Dzikie rośliny Arabidopsis inokulowane TRV Podwójny mutant dcl2-dcl4 inokulowany TRV Wyciszanie wirusa TRV w dzikich roślinach Arabidopsis zapobiega występowaniu symptomów choroby. Mutanty pozbawione aktywności Dicer są niezdolne do powstrzymania infekcji. This is an example of a genetic study revealing the critical role of DCL (and siRNAs) in suppressing damage by a virus. From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68–71. Reprinted with permission from AAAS.

Wirusy maja białka supresorowe, które zapobiegają wyciszeniu RNA DCL RdRP Poprzez zakłócenie procesu wyciszania RNA wirusowe białka supresorowe zakłócają mechanizm obrony rośliny przed wirusami. Supresory mogą działać na każdym etapie wytwarzania i funkcjonowania siRNA. These highly specific viral proteins are necessary for viral pathogenicity, as shown on the next slide. They are also important tools for dissecting the silencing pathway.

Małe RNA chronią także rośliny przed patogenami bakteryjnymi Rośliny dzikie (La-er) i mutanty w wytwarzaniu małych RNA (dcl1-9 and hen1-1) inokulowane bakteriami Pseudomonas. Reprinted from Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet, O. (2008) Suppression of the microRNA pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: 964-967. Reprinted with permission from AAAS.

Wyciszanie indukowane przez wirusy - podsumowanie Wyciszanie genów za pośrednictwem RNA jest ważnym narzędziem w obronie roślin przed patogenami. siRNA zakłócają replikację wirusów. siRNA działają systemicznie wspomagając obronę przed wirusami i oporność roślin. Większość wirusów wytwarza białka supresorowe procesu wyciszania RNA. Białka te stanowią ważne narzędzie w badaniu szlaków wyciszania RNA.

Wyciszanie transgenów Transgeny wprowadzone do roślin są często wyciszane przez szlak siRNA. Wyciszenie może być zaindukowane przez: Bardzo wysoki poziom ekspresji dsRNA pochdzące z transgenu Nietypowe RNA kodowane przez transgen Transgeny są wyciszane potranskrypcyjnie i transkrypcyjnie.

Wyciszanie indukowane przez trransgeny W latach 1980-tych opracowano metodę wprowadzania genów do genomów roślinnych za pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens. Wprowadzone geny noszą nazwe transgenów. Komórka roślinna Jądro DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona.

Indukowane przez transgeny wyciszanie potranskrypcyjne Doświadczenia nad modyfikacją koloru kwiatów petuni dostarczyły pierwszych dowodów na wyciszanie RNA.

Manipulacje ekspresją syntazy chalkonowej w celu modyfikacji pigmentacji kwiatów Antocjany Syntaza chalkonowa (CHS) Dzika roślina petuni wytwarza purpurowe barwniki antocjanowe Syntaza chalkonowa (CHS) jest enzymem działającym na początku szlaku syntezy antocjanów Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 8:25   doi:10.1186/1472-6750-8-25

Spodziewane – produkcja sensownego RNA syntazy chalkonowej (CHS) zwiększy pigmentację... Sensowny RNA Sense construct: PRO ORF Gen własny mRNA Transgen Translacja białka Dodatkowa translacja białka

..a produkcja antysensownego RNA zablokuje pigmentację Sensowny RNA Antysensowny RNA Konstrukt sensowny: PRO ORF Gen wlasny mRNA Transgen Translacja białka Dodatkowa translacja białka Konstrukt antysensowny: Tworzy się dupleks sens-antysens, który hamuje translację

Nieoczekiwanie, zarówno antysensowny jak i sensowny konstrukt hamował wytwarzanie pigmentu Rośliny z transgenem CHS CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : CHS Sens Antysens OR Photo credit Richard Jorgensen

Wyciszone tkanki nie wyrażają ani własnego ani wprowadzonego genu CHS RNA transgenu RNA własnego genu Purpurowe kwiaty Białe kwiaty To zjawisko, w którym zarówno wprowadzony, jak i własny gen ulegają wyciszeniu, nazwano kosupresją. The gel shows the two species of RNA produced in the plants. The upper band corresponds to the transgene RNA, and the lower the endogenous gene RNA. This experiment shows that the transgene induces silencing of the endogenous gene as well as the transgene, no CHS production from either gene, and no pigment production. Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279–289.

Kosupresja jest rezultatem wytwarzania siRNA PRO ORF Dzika mRNA Translacja białka Własny gen Sens RNA Sense construct Transgeniczna z kosupresją Kosupresja AGO AAAA siRNA jest wytwarzany The transgene triggers siRNA production which silences both genes. De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965–1970.

Najsilniejszym induktorem wyciszania RNA jest dwuniciowy RNA, co wykazano w badaniach na C. elegans Senowny RNA Antysensowny RNA Dwuniciowy RNA Brak efektu Nieskoordynowane skurcze Sensowny, antysensowny i dwuniciowy RNA homologiczny do genu unc-22 wprowadzono do C. elegans. Wyciszenie unc-22 powoduje utrate kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang.“uncoordinated”. Fragments of the unc-22 gene introduced as sense or antisense RNA had no effect on worm phenotype, whereas the double-stranded RNA caused a twitching phenotype indicating reduced gene activity levels. Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al., (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

Transkrypcyjne wyciszanie genów Małe RNA mogą inicjować wyciszanie DNA poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub zasocjowanych z nim histonów, zakłócając w ten sposób transkrypcję. Transkrypcja Ta forma wyciszania występuje często na stabilnie wyciszonym DNA i dotyczy np. centromerów i transpozonów, ale niekiedy dotyczy także genów. DNA Białka histonowe Wyciszanie This figure represents chromatin (DNA wrapped around histones) in an open and closed conformation. Chromatin modifications include covalent modifications to DNA and the histone proteins.

Transkrypcyjne wyciszanie genów CaMV 35S pro : KAN CaMV 35S pro : HYG Transkrypcyjne wyciszanie genów ujawniły doświadczenia, w których do roślin poprzez krzyżówki genetyczne wprowadzono więcej niż jeden transgen. Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk kanamycynę Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk higromycynę Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8: 643-649.

DNA methyltransferase siRNA mogą wskazywać DNA do wyciszenia poprzez metylację cytozyny lub za pośrednictwem enzymów modyfikujących histony O N NH2 ~ CH3 cytozyna 5-metylocytozyna Metylotransferaza DNA może być kowalencyjnie modyfikowany przez metylację cytozyny dokonywaną przez DNA-metylotransferazy . Metylacja DNA Dokładne mechanizmy, za pomocą których siRNA wskazują DNA do wyciszenia nie są znane, ale wiadomo, że wymagają działania dwóch specyficznych dla roślin kompleksów RNA-polimeraz: RNA Polimerazy IV (Pol IV) i RNA Polimerazy V (Pol V). AGO DNA methyltransferase Modyfikacja histonów

Rośliny zawierają dodatkowe kompleksy RNA polimeraz, które biorą udział w wyciszaniu DNA RNA RNA Polimeraza Kompleks Występowanie Funkcja RNA Polimeraza I Wszystkie eukariota Produkcja rRNA RNA Polimeraza II Produkcja mRNA, microRNA RNA Polimeraza III Produkcja tRNA, 5S rRNA RNA Polimeraza IV Rośliny lądowe Produkcja siRNA RNA Polimeraza V Rośliny nasienne Zciąganie AGO do DNA

Utrata funkcji genu RNA Pol IV zakłóca wyciszanie Arabidopsis z wyciszonym genem GFP Mutant nrpd1a-1. NRPD1A koduje podjednostkę RNA Polimerazy IV. Zielony kolor wskazuje, że GFP jest wyrażany wykazując, że Pol IV jest niezbędna do wyciszania. In the wild-type background, the red indicates endogenous chlorophyll fluorescence with no GFP expression; it is silenced. In the nrpd1a mutant, RNA Polymerase IV isn’t produced, interfering with silencing. From Herr, A.J., Jensen, M.B., Dalmay, T., and Baulcombe, D.C. (2005) RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118–120. Reprinted with permission from AAAS.

RNA Pol IV i V są potrzebne do wyciszania transkrypcyjnego RNA Pol V Metylacja DNA Modyfikacje histonów RNA Pol IV bierze udział w produkcji siRNA. Niekodujące RNA produkowane przez RNA Pol V skierowują maszynerię wyciszania do miejsc docelowych.

Większość siRNAs wytwarzana jest z transpozonów i powtarzalnego DNA Większość komórkowych siRNA pochodzi z transpozonów i innych powtarzalnych sekwencji. U Arabidopsis, (schemat powyżej) sekwencje te występują z wielką częstością w pericentromerycznych rejonach chromosomów. Ilość małych RNA Ilość transpozonów/ retrotranspozonów Chromosom Centromer Deep sequencing methods allow the population of siRNAs in a cell to be mapped onto their regions of homology. The abundance of small RNAs and transposons/ retrotransposons along each of the five Arabidopsis chromosomes is shown relative to the centromere (circle on each line representing the chromosomes). In Arabidopsis these repetitive elements occur primarily in pericentromeric regions. Transposons and repetitive elements are more dispersed in organisms with larger genomes. Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.

siRNA - podsumowanie Szlak siRNA wycisza obce DNA, transpozony i sedkwencje powtarzalne. U roślin, siRNA są wytwarzane przez białka podobne do Dicer rozcinające dsRNA na 24 nt siRNA. siRNA asocjuja z białkami AGO, z którymi tworzą kompleksy wyciszające. Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie na docelowe RNA, przecinając je lub zakłócając ich translację. Kompleksy wyciszające mogą również działać na chromatynę, wyciszając docelowe DNA przez metylację lub modyfikacje zasocjowanych z nim histonów.

microRNA - miRNA miRNA prawdopodobnie wyewoluowały z siRNA, oba te rodzaje małych RNA są wytwarzane i obrabiane w podobny sposób. U roślin występuje niewielka liczba silnie konserwowanych miRNA oraz duża liczba nie konserwowanych miRNA. miRNA są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale same działają na inne geny – sa czynnikami regulatorowymi działającymi w trans. U roślin miRNA regulują przede wszystkim rozwój i odpowiedzi fizjologiczne

microRNA - miRNA microRNA przecinają mRNA lub zakłócają ich translację AAAn RNA Pol II microRNA przecinają mRNA lub zakłócają ich translację DCL Gen MIR mRNA AGO Zakłócanie translacji Przecinanie mRNA

miRNA i siRNA podlegają obróbce przez pokrewne, ale odmienne białka DCL W roślinach występuje 4 lub więcej białek DCL , więcej niż w jakichkolwiek innych organizmach. Zwiększona różnorodność i liczba białek DCL ma prawdopodobnie związek z rozbudowanym systemem ochrony przed patogenami . AtDCL1 wytwarza miRNA AtDCL2 - 4 wytwarza siRNA DCL4 DCL1 Note that mammals make do with one dicer, and insects and fungi with two. Like most components of the siRNA pathway, dicer-like genes are amplified in plants. Reprinted from Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: 2442-2450 with permission from Elsevier.

miRNA i siRNA asocjują z kilkoma białkami AGO AGO1 preferencyjnie przecina sekwencje docelowe, asocjuje z miRNA, ale także z niektórymi siRNA AGO4 preferencyjnie asocjuje z siRNA i pośredniczy w metylalcji docelowego DNA. W Arabidopsis występuje 10 białek AGO. Nie są zbyt dobrze zcharaktery- zowane. Ich funkcje częściowo się nakładają Reprinted from Vaucheret, H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci. 13: 350-358 with permission from Elsevier.

Geny MIR są transkrybowane jako długie RNA, które są przekształcane w miRNA miRNA sa kodoane przez geny MIR Pierwotny transkrypt miRNA (pri-miRNA) składa się w strukturę dwuniciową, która podlega obróbce przez DCL1 Łańcuch miRNA* jest degradowany DCL 3' 5' miRNA miRNA* pri-miRNA MIR gene Cel miRNA

Niektóre miRNA są silnie konserwowanymi, ważnymi regulatorami genów Niemal połowa celów dla miRNA to czynniki transkrypcyjne. Niekonserwowane rodziny miRNA zwykle występują, jako pojedyncze geny Konserwowane miRNA zwykle duplikowały tworząc duże rodziny genowe Factors Fahlgren, N., Howell, M.D., Kasschau, K.D., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., Law, T.F., Grant, S.R., Dangl, J.L., and Carrington, J.C. (2007) High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: Evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS ONE. 2007; 2(2): e219.

Rodzina genów MIR156 jest silnie konserwowana w ewolucji miR156 jest silnie konserwowany w królestwie roślin miR156 wystepuje zarówno u nasiennych jak i u mchów miR156 jest kodowany przez sześć lub więcej genów w Arabidopsis Celami miR156 są c zynniki transkrypcyjne kontrolujące zmiany faz rozwojowych The red sequence indicates the miRNA produced from each of the six Arabidopsis MIR156 genes (MIR156A – MIR156F). The boxed sequence shows the miRNA*. Reprinted from Reinhart, B.J., Weinstein, E.G., Rhoades, M.W., Bartel, B., and Bartel, D.P. (2002) MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16: 1616–1626.

Cele niektórych konserwowanych miRNA Rodzina genowa miRNA Cel (rodzina genów) Funkcja 156 Czynniki transkrypcyjne SPL Czas rozwoju 160 Czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 165 Czynniki transkrypcyjne HD-ZIPIII Rozwój, polarność 172 Czynniki transkrypcyjne AP2 Czas rozwoju, tożsamość organów kwiatowych 390 TAS3 (tasiRNA), działa na czynniki transkrypcyjne ARF 395 Transporter siarczanów Pobieranie siarczanów 399 Ubikwitynacja białek Pobieranie fosforanu Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511..

miRNA u roślin wykazują odległe podobieństwa do swoich celów Duplikakcja genu Uważa się, że miRNA u roślin powstały ze swoich sekwencji docelowych w wyniku duplikacji genów, odwróconej duplikacji i dywergencji. Tylko niektóre miRNA zapewniają przewagę selekcyjną i są zachowywane i duplikowane. Reprinted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511 with permission from Elsevier.

miRNA i wegetatywne przejście fazowe Kiełkowanie zygota Faza juwenilna Wegetatywne przejście fazowe Wegetatywne przejście fazowe u roślin jest przemianą formy juwenilnej w dorosłą. Faza dorosła Faza reprodukcyjna Faza embrionalna

Wegetatywne przejście fazowe wpływa na morfologię i kompetencję reprodukcyjną roślin Dorosła Juwenilna A J Niektóre kaktusy mają zupełnie różne formy rozwojowe w fazie juwenilnej i dorosłej Photos courtesy of James Mauseth

W Arabidopsis, przejście fazowe wpływa na kształt liści i wzór włosków (trichom) Liście juwenilne są bardziej okrągłe, mniej ząbkowane i mają włoski tylko na górnej powierzchni. Liście dorosłe mają włoski na górnej i dolnej powierzchni. In the next few slides the leaves are color coded as juvenile (olive), adult (green) or reproductive (red) based on their morphology and anatomy. The boxes above the leaves schematically indicate the relative duration of each phase (for comparing wild-type and mutant plants). Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: 374-378, with permission from Elsevier.

Nadekspresja miR156 przedłuża fazę juwenilną w Arabidopsis Reprinted from Poethig, R.S. (2009) Small RNAs and developmental timing in plants. Curr. Opin. Genet. Devel. 19: 374-378, with permission from Elsevier.

Celem miR156 sa geny SPL promujące przejście fazowe Miejsce wiązania miR156 miR156 SPL ORF 3’ UTR Promoter SPL3 Geny SPL kodują rodzinę czynników transkrypcyjnych, które są celami dla miR156. W roślinach dzikich ekspresja miR156 spada z wiekiem, co pozwala na akumulację SPL i indukcję przejścia fazowego. The graph indicates the relative activity of miR156 and SPL, showing that as miR156 levels decrease SPL levels increase. When miR156 levels are high, SPL mRNA is cleaved and the protein can’t accumulate.

Przejście fazowe obejmuje czasową kaskadę miRNA i czynników transkrypcyjnych U Arabidopsis, SPL9 bezpośrednio aktywuje transkrypcję MIR172c Arabidopsis nadeksprymujące miR172 wykazuje przyspieszone kwitnienie Dziki miR172-nadekspr. miR156 SPL miR172 glossy15 Aukerman, M.J., and Sakai, H. (2003) Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes Plant Cell 15: 2730-2741.

miRNA regulują rozwój także u innych organizmów lin-14 mRNA lin-4 miRNA miRNA odkryto w badaniach nad regulacją rozwoju u C. elegans. miRNA kodowane przez lin-4 jest niezbędne dla prawidłowego rozwoju larwalnego. Gen lin-14 Rejon 3’ nie ulegający translacji Miejsca wiązania lin-4 Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambrose, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843–845. Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75: 855–862.

Hamowanie lin-14 przez lin-4 jest niezbędne dla normalnego rozwoju C Hamowanie lin-14 przez lin-4 jest niezbędne dla normalnego rozwoju C. elegans U dzikich C. elegans, lin-14 jest wyrażany we wczesnej fazie rozwoju, a następnie wyłączany. Ekspresja lin-14 Utrata funkcji lin-4 powoduje, że ekspresja lin-14 nie spada. Dziki C. elegans Mutant w lin-4 lin-4 jest negatywnym regulatorem lin-14. Lee, R.C., Feinbaum, R.L., and Ambrose, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75: 843–845. Wightman, B., Ha, I., and Ruvkun, G. (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75: 855–862.

miRNA i przejście fazowe - podsumowanie Wegetatywne przejście fazowe wpływa na morfologie i kompetencje rozrodczą miRNA biorą udział w kontroli czasu ekspresji genów i przejściu fazowym U C. elegans, wyciszenie lin-14 przez lin-4 is jest niezbędne dla normalnego przebiegu rozwoju.

miRNAs i sygnalizacja pokarmowa Przemieszczanie soli min. Pobieranie soli mineralnych Rośliny pobierają substancje pokarmowe z gleby. Pęd wysyła sygnały do korzenia informujące o zapotrzebowaniu pokarmowym. miRNAs migrują z pędu do korzenia via floem i regulują pobieranie pokarmu. © Heidi Natura of the Conservation Research Institute.

miR399 jest indukowany brakiem fosforanu w podłożu Geny kodujące miR399 ulegaja specyficznej indukcji przez pozbawienie roślin fosforanu Rośliny nadeksprymujące miR399 wykazują zwiększoną akumulację fosforanu The top figure shows expression levels of several miRNAs in response to different forms of nutrient starvation. The MIR399 genes are specifically induced during P starvation. Note that the MIR395 gene is induced upon S starvation. In the lower figure, the yellowness of the leaves in the mir399 overaccumulating plants is caused by overaccumulation of P to toxic levels. The measured amount of P in the leaves of the wild-type and mir399-overaccumulating plants is shown to the right; P accumulates in the shoots but not the roots. Bari, R., Pant, B.D., Stitt, M. and Scheible, W.-R. (2006) PHO2, microRNA399, and PHR1 define a phosphate-signaling pathway in plants. Plant Physiol. 141: 988–999; Chiou, T.J., Aung, K., Lin, S.I., Wu, C.C., Chiang, S.F. and Su, C.L. (2006) Regulation of phosphate homeostasis by microRNA in Arabidopsis. Plant Cell 18: 412–421.

Celem dla miR399 jest ligaza E2 dołączająca ubikwitynę Struktura genu E2 Miejsce wiązania miR399 Wzrost poziomu miR399 powoduje spadek ekspresji E2 Utrata funkcji E2 (aka pho2) (po lewej) powoduje zwiększoną akumulację fosforanu. miR399 E2 Akumulacja fosforanów The top panel shows the structure of the PHO2 (aka E2) gene, indicating the putative miR399 binding sites. The lower panel shows that miR399 is induced by P starvation, whereas PHO2 expression is complementary to miR399 expression. The panel to the right shows that loss-of-function of PHO2 causes P overaccumulation (the plant on the left is a pho2 loss-of-function mutant and showing signs of P-toxicity) as well as P overaccumulation, indicated by the bar graph. PHO2 is a negative regulator of P accumulation; loss-of-function of PHO2 causes P overaccumulation. Chiou, T.J., Aung, K., Lin, S.I., Wu, C.C., Chiang, S.F. and Su, C.L. (2006) Regulation of phosphate homeostasis by microRNA in Arabidopsis. Plant Cell 18: 412–421.

Ligaza E2 jest składnikiem szlaku proteolitycznego via ubikwitynacja CUL1 SKP1 F-box Kompleks SCF E3 26S proteosom Cel Ubikwityna E2 Szlak ubikwitynowy zaznacza białka do zniszczenia w proteasomie The target(s) affected by PHO2 accumulation are not known, but presumably these targets are targetted for proteolytic degradation by the PHO2/ E2 ligase in conjunction with the SCF E3 complex and the 26S proteosome. Adapted from Vierstra, R.D. (2009) The ubiquitin–26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10: 385-397.

tasiRNAs tasiRNAs – trans-acting siRNAS Kodowane przez geny TAS DICER TAS gene RNA Pol II AGO RDR6 tasiRNA są kodowane przez geny TAS transkrybowane przez RNA Pol II Transkrypt jest celem dla miRNA i zostaje rozcięty Rozcięty transkrypt jest kopiowany do dsRNA przez RNA zależną RNA polimerazę (RDR6) (dalszy ciąg na następnym przezroczu) tasiRNAs – trans-acting siRNAS Kodowane przez geny TAS Obróbka pierwotnego transkryptu inicjowana przez miRNA

Biogeneza tasiRNA DICER dsRNA jest rozcinany przez DCL4 na serię krótszych dsRNA, uwalniając z jednego genu TAS wiele cząsteczek tasiRNA. Arabidopsis zawiera cztery rodziny genów TAS Celami dla TAS1 i TAS2 tasiRNA sa geny kodujące białka z powtórzeniami pentapeptydowymi. Celem dla TAS3 tasiRNA są czynniki transkrypcyjne ARF (auxin response factors). Celem dla TAS4 tasiRNA sa czynniki transkrypcyjne MYB.

Z każdego genu TAS powstaje szereg ‘przesuniętych w fazie’ tasiRNA Miejsce wycięcia miRNA w pierwotnym transkrypcie tasiRNA mogą być wytwarzane z dowolnej nici DCL4 porusza się wzdłuż RNA mierząc i rozcianając go. Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207-221, with permission from Elsevier.

Mutacje wpływające na tasiRNA wpływają na przejście fazowe Mutacja rdr6-15 eliminuje wytwarzanie tasiRNA zip-1 eliminuje wytwarzanie TAS3 tasiRNA Obie mutacje oraz mutacje dcl4 i tas3, przyspieszają zmianę fazową Narrower leaves in the mutants as compared to the wild-type indicate accelerated phase change. This study shows that tasiRNAs are involved in phase change. They also have an import role in leaf development. Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: 939–944 with permission from Elsevier.

nat-siRNAs Nat-siRNAs – Natural cis-acting siRNAs Wytwarzane z zachodzących na siebie transkryptów. Udział w adaptacji do stresów abiotycznych i biotycznych AGO Zachodzące geny ds. RNA z komplementarnych transkryptów Wyciszenie Redrawn from Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18002–18007.

Zastosowania technologii małych RNA Wyciszanie genów służy do eliminacji alergenów z orzeszków ziemnych. Wyciszanie genów służy do usuwania szkodliwych związków z nasion bawełny, co pozwala na ich zastosowanie jako pokarmu. DNA tworzące siRNA lub miRNA mogą być stabilnie wprowadzane do genomów roślin w celu selektywnego wyciszenia genów. Kontrola zainfekowana przez pasożytniczegio nicienia Oporność indukowana RNAi Rośliny wyrażające dsRNA odpowiadające wybranym genom nicienia sa odporne na infekcje. Wchlonietę przez nicienia dsRNA indukuje wyciszenie jego genów. Kontrola szkodników The use of small RNAs in human therapies is likely to be of interest to some students as well; see lecture notes for more on these applications. Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302–14306.

Podsumowanie Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie genomu; specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu zasad. Celami dla siRNA sa bogate w sekwnecje powtarzalne rejony heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny. Celami dla miRNAs i tasiRNAs sa genby regulatorowe wpływające za czasowy i przestrzenny wzór rozwoju, homeostazę pokarmową i odpowiedzi na czynniki stresowe.